生物材料中分離純化澱粉酶教案設計

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　　一、目的和要求

　　1.掌握鹽析法初步分離純化蛋白質的原理和方法；

　　2.掌握透析脫鹽濃縮蛋白質的原理和方法。

　　3.掌握膜分離原理和方法

　　二、基本原理

　　1.蛋白質的鹽析

　　蛋白質是親水膠體，借水化膜和同性電荷（在PH值7.0的溶液中一般蛋白質帶負電荷）維持膠體的穩定性。由於蛋白質分子內及分子間電荷的極性基團有著靜電引力，當向蛋白質溶液中加入少量鹼金屬或鹼土金屬的中性鹽類[如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl或MgSO4等]時，由於鹽類離子與水分子對蛋白質分子上的極性基團的影響，使蛋白質在水中溶解度增大，因此蛋白質、酶等在低鹽濃度下的溶解質隨著鹽液濃度升高而增加，此時稱為鹽溶；當鹽濃度不斷上升並達到一定濃度時，蛋白質表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，於是蛋白質就相互聚集而沉澱析出，蛋白質和酶的溶解度又以不同程度下降並先後析出，稱為蛋白質的鹽析。

　　由鹽析所得的蛋白質沉澱，經過透析或用水稀釋以減低或除去鹽後，能再溶解並恢復其分子原有結構及生物活性，因此由鹽析生成的沉澱是可逆性沉澱。鹽析法就根據不同蛋白質和酶在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達到彼此分離的方法。鹽析法對於許多非電解質的`分離純化都是適合的，也是蛋白質和酶提純工作應用最早，至今仍廣泛使用的方法。

　　2.透析脫鹽的原理

　　蛋白質的分子很大，其顆粒在膠體顆粒範圍（直徑1～100nm）內，不能透過半透膜。選用孔徑合宜的半透膜，使小分子物質能夠透過，而蛋白質顆粒不能透過，這樣就可使蛋白質和小分子物質分開。把蛋白質溶液裝入透析袋中，袋的兩端用線紮緊，然後用蒸餾水或緩衝液進行透析，這時鹽離子透過透析袋擴散到水或緩衝液中，蛋白質分子量大不能穿透析袋而保留在袋內，透過不斷更換蒸餾水或緩衝液，直至袋內鹽分透析完畢。這種方法可除去和蛋白質混合的中性鹽及其他小分子物質，是常用來純化蛋白質的方法。透析需要較長時間，常在低溫下進行，並加入防腐劑避免蛋白質和酶的變性或微生物的汙染。

　　三、試驗材料

　　1.培養基

　　種子培養基：牛肉膏5g 蛋白腖10g NaCl 5g 可溶性澱粉 2g 葡萄糖1.5g /1000ml H2O 配100ml

　　發酵培養基：牛肉膏5g 蛋白腖10g NaCl 5g可溶性澱粉 2g /1000ml

　　2.酶活測定溶液

　　0.2mol/LpH6.8 PBS緩衝液葡萄糖標準液1mg/mL DNS試劑（3,5-二硝基水楊酸試劑）

　　3.試劑

　　蛋白腖、牛肉膏、可溶性澱粉、(NH4)2SO4、NaOH、HCl、、Na2HPO412H2O、NaH2PO4H2O、EDTA

　　4.儀器或其它用具

　　微量移液器、移液器槍頭、透析袋、恆溫培養箱、搖床、紫外檢測儀（分光光度計）、離心機、分析天平、pH計、量筒、250ml瓶、分裝架、記號筆、紗布、酒精燈、滅菌鍋、乾燥箱、恆溫水浴鍋等；

　　四、試驗路線

　　發酵培養→粗酶液製備→硫酸銨鹽析→透析脫鹽濃縮→濃縮酶液酶活測定

　　五、操作步驟

　　1.菌株發酵

　　將實驗一中純化的菌株接入種子培養基搖瓶培養24h，2% 的接種量接種到發酵培養基，37℃，180r/min，培養36h；

　　2.粗酶液的製備

　　發酵液在8000r/min離心20min，收集上清液即為粗酶液，測定酶活方法參見實驗三DNS測澱粉酶活力。

　　3.硫酸銨鹽析

　　3.1 鹽析條件的確定

　　40%、60%和80%

　　鹽析步驟

　　1）發酵液上清分裝至3支燒杯中，每個20ml；

　　2）加硫酸銨至3支燒杯中，對照25℃硫酸銨飽和度配置表，使其飽和度分別為40%、60%和80%。在加硫酸銨時需緩慢的加入，同時不斷的輕柔攪拌（否則區域性濃度過高會使酶失活）使硫酸銨完全溶解；

　　3）室溫靜置2h，出現白色沉澱

　　4）離心，分別取沉澱用少量0.2mol/LpH6.8 PBS緩衝液回溶。

　　4.透析脫鹽濃縮

　　4.1 透析膜前處理

　　透析袋的預處理方法：

　　1）將透析袋剪成合適的長度；

　　2）在一隻250 mL的玻璃燒杯中，加入200 mL的透析袋處理液，微波爐中預熱；

　　3）將透析袋裝入其中，電爐上煮沸10 min；

　　4）用蒸餾水徹底洗滌；

　　5）蒸餾水中煮10 min；

　　6）冷卻後4℃存放，存放過程中透析袋應完全放入0.02mol/L磷酸酸緩衝液（pH7.0）中

　　7 用細線紮緊透析袋一端，注入清水檢驗不漏後加入不超過透析袋體積1/2的須透析溶液。

　　4.2 操作

　　1 沉澱用少量0.2mol/LpH6.8 PBS緩衝液回溶，移入透析袋中，經透析膜袋在20倍量0.02mol/L磷酸緩衝液（pH7.0）中在室溫，36h透析脫鹽（每過6h換一次透析液).

　　2 取各梯度脫鹽沉澱5ml 8000r/min離心20min，取上清測酶活。（沉澱為變性蛋白質酶活很低。）

　　5.酶活力的測定

　　參照實驗三中的酶活測定。

　　六、實驗資料

　　粗酶液 540nm 0.291 0.314

　　鹽析40%60% 80%

　　1.221 2.708 1.456

　　七、實驗報告

　　1.實驗結果

　　（1）測定粗酶液酶活；

　　粗酶液 540nm 0.291 0.314 （取平均值)

　　酶活力9.705

　　（2）測定透析後酶液的酶活力

　　40%60% 80%

　　540nm吸光度 1.221 2.708 1.456

　　酶活力36.63 81.24 43.68

　　2.實驗結果分析

　　透過比較可知在硫酸銨飽和度為 60%時分離純化澱粉酶酶活力最高。經鹽析，透析除鹽後酶活力大大提高純化後的酶活力約為粗酶活力的4~9倍。

　　八、注意事項

　　（1）硫酸銨飽和度計算及加入方式：在分段鹽析時，加鹽濃度一般以飽和度表示，所需達到飽和度較高而溶液的體積又不再過分增大時，可直接加固體硫酸銨，其加入量見附表。注意看清是25℃硫酸銨飽和度表

　　（2）清洗透析袋內外時，操作過程中應使用鑷子或戴手套；

　　（3）蛋白質溶液用透析法去鹽時，正負離子透過半透膜的速度不同。以硫酸銨為例，NH4＋的透出較快.在透析過程中膜內SO42-剩餘而生成H2SO4，而使膜內蛋白質溶液呈酸性，足以達到使蛋白質變性的酸度，因此在用鹽析法純化蛋白質做透析去鹽時，開始應用0.1M的NH4OH透析，或者用緩衝液配製蛋白溶液。