淺談丹參酮ⅡA對心肌細胞損傷的修復作用的分析論文

　　1 材料

　　1.1 動物出生1～3 d雄性Wistar大鼠，SPF級，購自南方醫科大學實驗動物中心，合格證號SCXK粵-20060015。

　　1.2 藥品與試劑

　　胎牛血清購自杭州四季青生物工程研究所；胰蛋白酶、DMEM培養基購於Gibico公司；丹參酮ⅡA購於中國藥品生物製品檢定所（批號110766-200417）；乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。

　　2 方法

　　2.1 分組原代乳鼠心肌細胞經分離、純化後進行實驗分組，分為以下幾組：①正常組：培養的正常心肌細胞培養；②模型組：心肌細胞培養液中新增200 μmol/L H2O2作用2 h；③丹參酮ⅡA高劑量組：心肌細胞用丹參酮ⅡA 1×10-4mol/L培養24h後新增200 μmol/L H2O2繼續作用2 h。④丹參酮ⅡA中劑量組：心肌細胞用丹參酮ⅡA 5×10-5mol/L培養24 h後新增200 μmol/L H2O2繼續作用2 h。⑤丹參酮ⅡA低劑量組：心肌細胞用丹參酮ⅡA 1×10-5mol/L培養24 h後新增200 μmol/L H2O2繼續作用2 h。

　　2.2 新生大鼠心肌細胞培養參照Goldenberg等［4］方法略加改進。取出生1～3 d SD乳鼠，在75％酒精中浸泡8s後取出，固定四肢。用無菌眼科剪剪開胸部，無菌眼科彎鑷取出心臟。迅速將心臟放入裝有冷D-Hanks液的培養皿中，去除心房及心外膜的結締組織，將心室剪開，洗淨殘血，反覆洗3次。將心室肌在無菌培養皿側壁剪碎成1～2 mm3的小組織塊。將小組織塊移入50 ml塑膠離心管中，加入0.1％胰蛋白酶5ml，37℃消化6 min。自然沉澱後去除第1次上清，再加入5 ml胰蛋白酶於37℃消化6 min後，輕輕吹打，自然沉澱後，取上清移入15 ml離心管中，加含血清培養基終止消化，1 000 r/min離心10 min，洗兩次。剩餘沉澱繼續加胰蛋白酶消化，如此反覆消化7～10次直至組織塊完全消化。將離心所得沉澱用含15％胎牛血清的培養基製成細胞懸液，在CO2培養箱中差速貼壁1 h，去除非心肌細胞（主要是成纖維細胞和內皮細胞）。1 h後輕輕吸出細胞懸液，調整細胞密度，將心肌細胞懸液均勻接種於6孔板內，置於二氧化碳培養箱中培養。前48 h加入終濃度為0.1 mmol/L的5-溴脫氧尿苷，每24 h換液1次。

　　2.3 心肌細胞活力檢測採用MTT比色法測定心肌細胞活力。心肌細胞懸液以1.5×104/ml接種於96孔板。分組處理後，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），在培養箱中37℃孵育4 h。吸去上清，每孔加入DMSO 150 μl。微孔振盪器上振盪10 min。酶標儀檢測570 nm波長的吸光度值。每孔OD值減去空白孔OD值為測試孔OD值。活細胞數與OD值成正比。每組每個時間點設6個復孔，取其平均值。

　　2.4 心肌細胞凋亡吸出培養液，D-Hanks洗細胞3次，5 min/次。向培養瓶中加入2～3 ml 0.125％胰蛋白酶（使用前應預熱至37℃左右），鏡下觀察細胞，待其變圓，細胞間分離但尚未脫落時倒去胰酶，加入原培養液終止消化，吹打瓶壁，使細胞脫落。將細胞懸液轉移至離心管，1 000 r/min 離心5 min，加PBS重懸細胞，調整細胞濃度為1×106/ml，取0.5 ml上述細胞懸液，1 000 r/min 4 min離心，棄上清，加0.5 ml Binding Buffer重懸細胞，加入1μl熒游標記的Aannexin V試劑，混勻後避光室溫下孵育20 min。加入5μl PI混勻後避光4℃下孵育5 min，孵育後加入500 μl Binding Buffer，立即上流式細胞儀分析，激發波長Ex=488 nm; 發射波長Em=530 nm。

　　2.5 總抗氧化能力及氧化平衡體系酶測定

　　採用比色法測定總抗氧化能力（T-AOC），採用2,4-二硝基苯肼顯色法檢測LDH活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH-Px含量，鉬酸銨法測定CAT活力。具體操作步驟參照試劑盒說明書。

　　2.6 統計分析

　　計量資料以均±s表示，採用 SPSS13. 0統計軟體進行分析。多組資料間比較採用單因素方差分析（One Way ANOVA）處理，組間兩兩比較採用LSD法。檢驗顯著性水準α＝0.05。

　　3 結果

　　3.1 丹參酮ⅡA對過氧化氫所致心肌細胞損傷的細胞活力與細胞凋亡的影響與正常組比較，模型組心肌細胞活力顯著降低，細胞凋亡率則顯著增加；在改善細胞活力方面，丹參酮ⅡA高劑量組細胞活力較模型組顯著增高，而丹參酮ⅡA中劑量、低劑量與模型組比較無統計學差異。在改善細胞凋亡率方面，丹參酮ⅡA各劑量組細胞凋亡率均顯著低於模型組，中劑量與低劑量差異無統計學意義。丹參酮ⅡA對過氧化氫所致心肌細胞損傷抗氧化能力的影響與正常對照組比較，模型組心肌細胞總抗氧化能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性顯著降低，而LDH活性、MDA含量則顯著增加；丹參酮ⅡA可呈劑量依賴性增加總抗氧化能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性，降低LDH活性、MDA含量。