分離培養及鑑定骨髓間充質幹細胞的方法探析論文

　　骨髓間充質幹細胞（BMSCs）也被稱為間質祖細胞，由於其巨大的增殖和多向分化潛能，被認為是再生醫學、基因治療和細胞治療的理想種子來源，已被廣泛進行研究[1-3].目前，BMSCs在動物實驗和臨床應用上取得了巨大的成果，在骨、軟骨、肌腱、神經膠質修復、心臟疾病、心肌梗塞、肝臟損傷等方面取得了重大突破[4-6],並且可避免胚胎幹細胞和異基因幹細胞治療所涉及的倫理道德和免疫排斥問題，有利於細胞移植。但是骨髓中的BMSCs含量極少，約佔骨髓全細胞的0.001%~0.010%[7];因此，需要在體外分離純化、培養擴增來滿足臨床應用和實驗研究。研究表明，不同分離方法和首次換液方式對BMSCs的增殖培養有很大的影響[8].本試驗透過觀察2種不同分離方法和不同首次換液時間對兔BMSCs生物活性的影響，旨在建立一種有效的分離培養及鑑定BMSCs的方法，以便獲得大量、高純度、高活性、培養週期短的BMSCs,為下一步研究和臨床實驗提供基礎。

　　1 材料與方法

　　1.1實驗動物1月齡雄性紐西蘭大耳白兔1只，由河南省實驗動物中心提供。

　　1.2主要試劑和儀器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜爾迪生物公司）；DMSO（Gibco）；紅細胞裂解液（北京賽馳生物技術有限公司）；生物素標記山羊抗兔IgG、HRP標記鏈黴親和素、DAB顯色試劑盒、改良型蘇木素（北京華肽先鋒）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗體（北京博奧森）；封閉山羊血清（北京博奧森）。

　　HF151UV型CO2培養箱（Heal Force）；倒置顯微鏡（Leica）;800型離心機、85-2恆溫磁力攪拌器：金壇市大地自動化儀器廠；數碼相機：日本佳能IXUS 980IS;電子天平：METTLER TOLEDO AL104;超淨工作臺：AIR TECH;FX101-2型電熱鼓風乾燥箱：上海樹立儀器儀表有限公司；pH計：上海雷磁儀器廠。

　　1.3 BMSCs的提取用陸眠寧（846）將1月齡紐西蘭大耳白兔麻醉，腿部去毛消毒，無菌條件下分離股骨、脛骨，剔除脂肪和肌肉，PBS液反覆沖洗，剪斷兩側幹骺端，儘量多保留幹骺端，DMEM-F12培養液反覆沖洗骨髓腔於A、B兩個10mL的離心管內，直至骨髓腔發白，1 000r/min離心5min,棄上清。

　　1.4全骨髓貼壁法A管用PBS重懸細胞，1 000r/min離心5min洗滌2次，棄上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12（1∶100雙抗）培養液重懸細胞，接種至3個25cm2培養瓶，補足培養液至5mL,輕柔吹打均勻。置於37℃、5%CO2條件下培養。以後每3d換液1次，待細胞生長融合至80%時傳代培養。先棄去舊培養液，PBS液浸洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以1∶2的比例傳代培養，每3d換液1次。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

　　1.5紅細胞裂解法B管加入1mL紅細胞裂解液重懸細胞，靜置1~3min,待液體由紅色變為白色後，加入5 mL PBS液，1 000r/min離心2次，5min/次，棄上清。吸取3 mL含10% FBS的DMEM-F12（1∶100雙抗）培養液重懸細胞，接種至3個25cm2培養瓶，補足培養液至5mL,輕柔吹打均勻。置於37℃、5%CO2條件下培養。

　　2d後首次換液，以後每3d換液1次，待細胞生長融合至80%時傳代培養。先棄去舊培養液，PBS液浸洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以1∶2的比例傳代培養，每3d換液1次。每天倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

　　1.6兔BMSCs細胞活性檢測及生長曲線繪製培養48h時，各取一瓶細胞，棄去培養基，用PBS沖洗2遍，倒置顯微鏡下觀察細胞。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化後，0.4%臺盼藍染色，血球計數板計數活細胞（未著色）和死細胞（著色細胞）。分別計算出2種不同分離方法的細胞活性。上述試驗重複3次。

　　選取生長良好的P1、P3和P8代細胞，以2.0×104個/孔，接種於24孔培養板中，每孔1mL,每3d換液1次，每隔1d取3孔，消化後計數，取其平均值為當天的細胞數，連測8d,以培養時間為橫座標，細胞數為縱座標，繪製細胞生長曲線。

　　1.7首次換液時間對兔BMSCs的影響將用紅細胞裂解法分離得到的兔BMSCs按首次換液時間隨機分為4組：12h換液組、24h換液組、48h換液組、72h換液組，以後每3d換液1次，記錄傳代前各組0~3代各代培養時間，各代細胞均保留3瓶。

　　1.8細胞免疫組化鑑定兔BMSCs收集紅細胞裂解法的P3代細胞，製備細胞爬片，常規SABC免疫組織化學方法檢測表面抗原CD34、CD、CD45、CD90的表達。

　　1.9統計學處理所得資料以均數±標準誤表示，應用SPSS16.0統計學軟體進行處理，採用單因素方差分析（one-way ANOVA），用Microsoft Excel軟體作圖。

　　2 結果

　　2.1不同分離方法對兔BMSCs形態和生長的影響

　　剛接種時，2種不同分離方法所得的.原代細胞在倒置顯微鏡下觀察細胞呈圓形，大小一致，折光性強，不容易區分。培養48h後，A、B兩組細胞均可看見有圓形、短梭形、多角形細胞貼壁。

　　B組貼壁細胞較A組細胞多（圖1）。臺盼藍染色檢測細胞活性全骨髓貼壁法（A組）為90%,紅細胞裂解法（B組）為96%.隨著培養的繼續，大量細胞貼壁，並出現典型的BMSCs細胞集落，緊密排列。

　　A組細胞生長較緩慢，所得細胞純度較低；B組細胞生長較快，純度較高。原代細胞達到傳代的時間A組為10.2d,B組為7.2d,差異顯著（P<0.05）。B組細胞P3代細胞呈旋渦狀或放射狀生長，細胞形態大小均一（圖2）.

　　2.2兔BMSCs生長曲線繪製

　　透過細胞計數法繪製細胞生長曲線，對兔BMSCs的生長特性進行鑑定。結果顯示，P1、P3、P8代細胞培養過程中，細胞生長具有相似的特點：1~2d細胞處於潛伏期；3~6d細胞處於對數生長期；6~8d生長逐漸減慢，開始進入平臺期（圖3）。傳代細胞生長相對穩定，隨著傳代次數的增加，細胞會出現衰老的特徵，增殖速度減慢。

　　2.3兔BMSCs的鑑定

　　結果顯示，CD44、CD90抗原表達陽性，CD34抗原表達陰性（圖4），符合BM-SCs表面分子標記特徵。

　　2.4首次換液時間對兔BMSCs培養週期的影響紅細胞裂解法分離兔BMSCs,分別在12,24,48,72h首次換液，結果（表1）顯示，24h換液組P0、P1、P2、P3代以及總時間的細胞培養時間與其他各組比較差異極顯著（P<0.01），表明24h首次換液可縮短細胞培養週期。

　　3 討論

　　骨髓中BMSCs的含量很低，一般為0.001%~0.010%,其數量和生長能力與年齡呈顯著負相關，想要在臨床實踐中利用BMSCs,就必須實現其在體外的分離培養和擴增。目前，常用的BMSCs的分離和純化方法有：全骨髓貼壁法、紅細胞裂解法、密度梯度法、免疫磁珠分選法和流式細胞術分選法，後2種方法篩選BMSCs的分選效率和純度均較高，但是對實驗條件和裝置要求較高，費用昂貴，並且BMSCs表面缺乏特異性標誌，在具體操作過程中可造成細胞的損傷和死亡，所以較少使用[9].密度梯度法由於分離液往往對BMSCs有一定的損傷，且離心會丟失大量的細胞，對細胞活性有影響，因此應用受到很大限制[10].本試驗透過比較全骨髓貼壁法和紅細胞裂解法，發現2種分離方法均可得到較均一的長梭形細胞，聚整合旋渦狀均勻生長。但是紅細胞裂解法分離得到的BMSCs在48h時貼壁細胞顯著多於全骨髓貼壁法，並且細胞活性較高，細胞密度達到80%融合，首次傳代時間也較短。這可能是因為全骨髓貼壁分離法保留了造血幹細胞和其他雜細胞，在體外培養過程中混雜的細胞會對BMSCs的生長及貼壁產生影響，所得BMSCs純度和細胞活性均較低；而紅細胞裂解液的有效成分是氯化銨，能夠利用紅細胞的滲透脆性特異性的破壞無核紅細胞膜而去除紅細胞和血小板，並且對有核細胞無影響，從而去除骨髓中含量最高的細胞成分，經紅細胞裂解液處理後，減小了雜細胞對其貼壁的影響，為BMSCs貼壁保留了空間，有利於BMSCs的早期貼壁[11],所得細胞純度高，且細胞活力不受影響。因此，利用紅細胞裂解法，能夠在較短的時間裡獲得大量的高純度、高活性的目的細胞，是一種有效的分離純化BMSCs的方法。

　　有研究表明，首次換液時間對BMSCs的生殖增長有一定的影響。原代首次換液時間過早，由於骨髓沖洗液中其他細胞分泌滋養BMSCs的生長因子等多種有益成分丟失，貼壁細胞數量減少，細胞生長緩慢，細胞培養週期延長；原代首次換液時間過晚，雜質貼壁緊密，細胞代謝產物等有害成分增多，造血幹細胞分泌的生長因子使BMSCs出現分化等，從而導致細胞增殖週期延長。本試驗分別在12,24,48,72h首次換液，24h換液組，首次傳代時間及細胞培養總週期與其他各組比較，差異有顯著性意義，能顯著縮短細胞培養時間，因此，培養24h首次換液為最佳首次換液時間。

　　BMSC目前還沒有發現特異性的表面標記物，其鑑定尚無統一標準。

　　BMSC的表面抗原具有非專一性，表達內皮細胞、間質細胞、表皮細胞和肌肉細胞的表面標誌，它包括（1）粘附分子CD44、CD105、CD166、CD54、CD102等；（2）整合素家族成員CD29、CD104、CD49a等；（3）其他CD90等[12-14].不表達造血幹細胞表面標誌，如CD34、CD45、CD11b、CD11a等[15-16].BMSCs,結果顯示，BMSCs陽性表達CD90和CD44,造血幹細胞標志CD34呈陰性表達，符合BMSCs的表面標誌物特徵，證實我們體外分離培養的細胞為純化的BMSCs.

　　綜上所述，透過紅細胞裂解液法分離得到的兔BMSCs生長增殖旺盛，生物學性狀穩定，於培養24h首次換液可顯著縮短細胞的培養週期，便於後續的試驗研究。