不同基因型青花菜遊離小孢子培養的幾個方法分析論文
不同基因型青花菜遊離小孢子培養的幾個方法分析論文
青花菜( Brassica oleracea var. italica) ，俗名綠菜花。由於其營養價值高，尤其是在抗癌功能上為同類蔬菜之首，深受消費者青睞。我國青花菜品種多為國外引進，種子昂貴。為培育新的種質資源，育成優質青花菜品種，常規方法需經過雜交、回交和自交分離，選育出理想的材料常常需要好幾個世代。而在青花菜育種中利用小孢子組織培養，不僅可快速得到雙單倍體純系，還可大大縮短育種年限[1-4]。自1982年至今，甘藍型油菜小孢子培養獲得胚狀體後，國內外利用遊離小孢子培養技術在蕓薹屬作物上相繼取得成功[5]，1991年Takahata等[6]首次利用青花菜進行了小孢子培養，隨後張德雙等[7]、王春麗[1]等也在青花菜遊離小孢子培養上取得了成功。雖然小孢子培養技術日趨成熟，但很多學者側重於對小孢子胚胎髮育的誘導因素進行研究，本試驗以5個不同基因型的青花菜為材料，對遊離小孢子培養與植株再生進行了研究，旨在完善青花菜小孢子培養技術，同時也可為青花菜的遺傳育種提供新的材料。
1 材料和方法
1.1 材 料
供試材料由天津科潤蔬菜研究所提供，供試材料於2012年10月定植於天津市科潤蔬菜所，採取常規栽培管理，翌年3—4月植株出現花蕾後，選取主花序上的花蕾進行小孢子培養。
1.2 小孢子培養方法
參考張德雙等[7]的研究，取處於單核晚期和雙核早期的花蕾(4.1~5.0 mm)的小孢子進行培養。小孢子的分離、純化培養參考趙前程等[8]的方法，用50 g·L-1質量濃度的次氯酸鈉溶液進行表面消毒，經無菌水沖洗，用含蔗糖為100 g·L-1的B5培養基進行遊離、洗滌，用含蔗糖為130 g·L-1，pH 值5.8，新增6-BA(1 mg·L-1)和NAA(0.1 mg·L-1)的NLN液體培養基進行小孢子培養，並新增一定的活性炭，培養密度為1×105~2×105個·mL-1，熱激後，置25 ℃培養箱中繼續暗培養，利用倒置顯微鏡觀察小孢子發育進展。
1.3 胚胎發生與胚培養
小孢子受到熱激後開始細胞分裂，黑暗培養2周左右，肉眼可見胚狀體。30 d左右，胚狀體處於子葉期，轉移至新增6-BA(0.2 mg·L-1)和NAA(0.02 mg·L-1)的MS培養基上，形成再生芽。
1.4 植株再生與移植
將小孢子的再生芽在MS培養基上進行生根培養，形成完整植株，對試管苗進行增殖培養，擴大植株數量，加快育種，經過馴化移栽到含基質的盆缽中，待小植株成活後，移栽至大田，進行管理。
2 結果與分析
2.1 小孢子離體培養的生長髮育觀察
經過熱激的青花菜小孢子逐漸膨大(圖1-A)，2周左右，小孢子從多細胞團結構，逐漸發育成球形胚(圖1-B)、心形胚(圖1-C)、魚雷胚(圖1-D)和子葉胚(圖1-E)，將子葉胚置於光照下培養5~7 d，可見胚狀體萌發，10~15 d左右，形成叢壯苗(圖1-F)，利用叢壯苗在MS培養基上進行生根培養，7 d左右，可見植株的基部產生大量白色的粗壯的根，形成健壯植株(圖1-G)。
2.2 不同基因型小孢子胚誘導的差異比較
由表1可以看出，供試的`5個材料中，只有兩個形成了小孢子胚，胚胎誘導成功率為40%。不同基因型的小孢子胚誘導成功頻率存在差異，11J-52每花蕾平均產胚數達到2.1個，而11J-63僅有0.5個。在未出胚的3個基因型中，11J-150和11J-158都觀察到了細胞膨大，11J-173觀察到了細胞分裂，說明它們對培養條件產生了反應，但卻未能繼續發育。由此可見，基因型對小孢子胚胎髮育有明顯影響。
2.3 小孢子植株再生
再生植株在花球形成期和開花期存在分離情況見圖2。11J-52和11J-63兩種材料均未採用任何加倍處理，兩份材料產生的再生植株只有少部分植株不能表現出十字形花冠，而呈現出一字型。80%以上的植株可育，並且能正常自交結角。
3 結論與討論
利用小孢子培養不僅能夠快速有效地獲得純系植株，加快青花菜的育種程序，而且利用單倍體植株的突變來篩選抗病、抗旱、抗蟲的青花菜植株顯得更加便捷[9]。
基因型是制約小孢子發育的重要因素[10]。在相同的試驗條件下，不同基因型誘導小孢子發育的頻率差異很大，本研究中，基因型11J-52達2.1個，而11J-63則僅有0.5個，其他3個基因型(11J-150，11J-158，11J-173)則只有細胞膨大和部分細胞分裂，這個結果可以為青花菜遊離小孢子培養提供理論依據。但是，關於小孢子培養的啟動機制、微觀發育機制、發育途徑以及與之相關的生理生化方面的研究仍在探究過程中。
本試驗中同時還發現高溫熱激可以啟動小孢子分化，但是，熱激又會對小孢子造成一定的傷害，這與一些研究者得出的結果相類似[11]，如何克服這一傷害，找出最適宜的高溫預處理方式、處理時間與溫度以增加出胚率還有待進一步研究。此外，本試驗獲得的再生植株均透過自然加倍所得，其可能是單倍體、多倍體及非整倍體構成的混合群體。試驗中觀察到的具有一字型花冠的再生植株可能是非整倍體。透過小孢子胚產生的再生植株在農藝性狀上的差別與植株倍性之間的聯絡還有待研究。
參考文獻:
[1] 王春麗，王濤濤，張餘洋，等.青花菜小孢子胚植株再生及倍性研究[J].中國蔬菜，2010(4):36-40.
[2] 方淑桂，陳文輝，曾小玲，等.大白菜遊離小孢子培養若干技術研究初報[J].福建農業學報，2003，18(2):123-126.
[3] 湯青林，宋明，張鍾靈.甘藍類蔬菜遊離小孢子培養研究進展[J].西南農業學報，2000，13(3):98-103.
[4] 張曉芬，王曉武，張延國，等.花椰菜遊離小孢子培養再生植株研究[J].中國蔬菜，2005(1):16-17.
[5] Lichter R.Induction of haploid plant from isolated pollen of brassica napus[J]. Z Pflanzenhysiol，1982，105(5):427-434.
[6] Takahata Y， Keller W A. High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica oleracea L[J].Plant Science，1991，74:235-242.
[7] 張德雙，曹鳴慶，秦智偉.青花菜遊離小孢子培養、胚胎發生和植株再生[J].華北農學報，1998，13(3):102-106.
[8] 趙前程，吉立柱，蔡榮旗，等.花椰菜遊離小孢子培養及植株再生研究[J].華北農學報，2007，22(6):65-68.
[9] 李超，饒勇，陳靜，