HIV-1Rev蛋白和人DDX3解旋酶對HCVRNA複製產生的作用研究論文

　　丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)和人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)的傳播途徑十分相似，約30%的HIV陽性患者合併HCV感染。在中國的靜脈藥癮的HIV感染者中，HCV陽性率可高達90%。HCV患者合併感染HIV將加速丙型肝炎病程進展，同時降低抗HCV療效。近年較多研究表明，對合並感染患者針對HIV進行嚴格的高效抗逆轉錄病毒治療(highlyactiveantiretroviraltherapy，HAART)不能有效地改善這些情況，同時HCV病程加速也與CD4+T淋巴細胞數量下降無明顯關聯。我們前期的研究也證實，HIV合併感染可能導致患者體內HCV準種分佈特徵改變，但HCV載量及準種複雜度與CD4+T淋巴細胞數量無關。以上證據提示HIV對HCV的影響可能存在其他途徑。有研究證實HCV、HIV可以共感染同一肝細胞，進而可能導致兩種病毒在同一細胞內發生相互作用。HCV、HIV均為RNA病毒，而DDX3在人體細胞內與RNA的複製過程關係密切，已有研究證實DDX3可與HCVCore蛋白結合促進HCV的複製。同時發現HIV-1Rev蛋白可與DDX3結合在核膜上形成複合體從而導致細胞質內DDX3的水平下降，也有研究表明，Rev蛋白可以與HCV5'-UTR作用直接促進HCV的複製。但是尚未有研究證實Rev蛋白可以透過間接作用影響HCV的複製，或透過影響其他細胞代謝途徑影響HCV的複製，也沒有研究證實Rev蛋白和DDX3可以共同作用並對HCV的複製產生影響。

　　本實驗透過分別構建HCVRNA複製細胞模型及表達DDX3、Rev+DDX3的HCVRNA複製細胞模型，研究Rev蛋白和DDX3對HCVRNA複製的影響。旨在為進一步深入研究Rev蛋白和DDX3是否透過共同作用，從而影響HCVRNA複製。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　Huh7肝癌細胞系和HCV複製模型pCDNA3.1-JFH1均為本實驗室儲存，Huh7細胞系生長於含10%滅活小牛血清、2mmol/L谷氨醯胺、氨苄青黴素(100U/mL)、鏈黴素(100U/mL)和DMEM培養基中，37℃、5%CO2條件下培養。實驗中主要材料包括:真核過表達質粒pCDNA3.1(鼎國生物技術有限公司，北京)，各種工具酶、核酸標準分子量Marker以及蛋白質預染Marker(天根生化有限公司，北京)，去內毒素質粒大量提取試劑盒(Qiagen公司，德國)，質粒轉染轉染試劑Lipofectamine2000(Invitrogen公司，美國)，鼠抗Flag單克隆抗體(Sigma公司，美國)、兔抗人GAPDH單克隆抗體、小鼠抗人DDX3單克隆抗體、小鼠抗HIVRev單克隆抗體(Abcam公司，美國)，HRP標記的羊抗兔IgG二抗，HRP標記的羊抗小鼠IgG二抗(福州邁新公司中國)，qPCR引物由Invitrogen公司合成。

　　1.2方法

　　1.2.1含Rev、DDX3基因重組真核表達載體的構建查詢NCBI獲得Rev蛋白和DDX3的基因表達序列，並分別在其基因的5'端引入限制性酶切位點EcoRⅠ和增強表達的Kozak序列，3'端引入限制酶切位點XbaⅠ和便於Rev、DDX3表達檢測的Flag標籤蛋白(DYKDDDDK)編碼序列，以及便於觀察轉染效率的mCherry和YFP序列。以上相關基因序列由深圳華大生物科技有限公司協助合成。進一步分別將各自基因序列插入真核過表達載體pCDNA3.1中命名為pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pcDNA3.1-DDX3-YFP-Flag。從GenBank中查詢目的基因以及上下游的序列，用VectorNTI軟體進行PCR引物設計。載體pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry正向引物(5'-AGTCCAGTGTGGTGGAATTCGCCACCATGGAGCCAGTAGATCCTAG-3')(含同源重組序列、EcoRⅠ酶切位點、Kozak序列，並含有目的基因5'端配對序列)，(5'-TAGTCCATGGTGGCGAATTCTTCTTTAGTTCCTGACTCCAATAC-3')(含同源重組序列、EcoRⅠ酶切位點，並含有目的基因3'端配對序列)。載體pcDNA3.1-DDX3-YFP-Flag正向引物5'-ACGATGACGATAAGCTCGAGGCCACCATGAGTCATGTGGCAGTGG-3'(含同源重組序列、XhoⅠ酶切位點、Kozak序列，並含有目的基因5'端配對序列)，反向引物5'-GTTTAAACGGGCCCTCTAGATCAGTTACCCCACCAGTCAAC-3'(含同源重組序列、XbaⅠ酶切位點，並含有目的基因3'端配對序列)。

　　1.2.2重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pcDNA3.1-DDX3-YFP-Flag質粒的鑑定用構建好的重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pcDNA3.1-DDX3-YFPFlag質粒分別轉化入大腸桿菌DH5α中，均勻塗布接種於含有氨苄青黴素的瓊脂糖平板上，次日挑取陽性單克隆菌落搖菌擴增後，抽提質粒進行PCR擴增並進行瓊脂糖凝膠電泳，對擴增產物進行回收，並進行核酸測序。

　　1.2.3重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag及pCDNA3.1-JFH1質粒的轉染採用Lipofectamine2000轉染試劑，實驗步驟按照使用說明書進行操作。將重組pCDNA3.1-Rev-FlagmCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag質粒分別瞬時轉染入Huh7細胞中，透過熒光顯微鏡觀察轉染效率。pCDNA3.1-JFH1瞬時轉染入Huh7細胞中，qPCR檢測HCV的複製情況。

　　1.2.4Westernblot鑑定Rev、DDX3基因在Huh7細胞中的表達分別轉染48h後，提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳。在4℃下、300mA恆流條件下電轉120min，用封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST)室溫封閉PVDF膜1h，TBST洗膜3次，每次10min，一抗加入1∶5000比例稀釋的anti-Rev單克隆抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10min，二抗加入1∶5000比例稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育2h，TBST洗膜3次，每次10min。化學發光試劑檢測，以GAPDH為內參。

　　1.2.5qPCR檢測細胞內Rev、DDX3對HCV複製的影響用Lipofectamine2000轉染試劑，實驗按照使用說明書進行操作。將pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag和pCDNA3.1-JFH1瞬時共轉染入Huh7細胞中，qPCR檢測HCV複製情況。將pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag及pCDNA3.1-JFH1瞬時共轉染入Huh7細胞中，qPCR檢測HCV複製情況。查詢NCBI中HCV基因組序列，以5'非翻譯區為模板設計引物，引物序列為HCV-F:5'-CCCTGTGAGGAACTACTGTCTT-3';HCV-R:5'-TGAGCGGGTTTATCCAAG-3'。引物序列由美國Invitrogen公司合成。擴增條件為95℃預變性1min，95℃變性10s，58℃退火擴增30s，迴圈40次，最後新增65～95℃溶解曲線。標準曲線:取1μgPCDNA3.1-JFH1按10倍梯度稀釋5個梯度後按上述體系進行Real-timePCR檢測，最終將每個梯度的Ct值帶入對應終濃度計算函式，最終以該函式計算每個樣品中對應的HCV複製水平。

　　1.3統計學處理

　　採用SPSS17.0進行統計，實驗組與對照組採用兩獨立樣本t檢驗檢測均值是否有顯著性差異。

　　2結果

　　2.1重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag真核表達載體的鑑定含pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherryg質粒的菌液經擴增培養後提取純化質粒，進行PCR鑑定，產物經5%瓊脂糖凝膠電泳，分別出現1條特異性條帶，均位於400bp附近。核酸序列測定結果顯示，克隆的外源基因全長394bp。含pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag質粒的菌液經擴增培養後提取純化質粒，進行PCR鑑定，產物經5%瓊脂糖凝膠電泳，分別出現2條特異性條帶，分別位於2000bp附近，選擇與預期產物大小接近的條帶進行膠回收並測序。核酸序列測定結果顯示，克隆的外源基因全長2035bp。透過對克隆的外源基因序列測序並和GenBank中Rev和DDX3序列對比，證實其基因序列100%同源，提示Rev和DDX3真核表達載體構建成功。

　　2.2Rev、DDX3基因分別在Huh7細胞中的表達重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag質粒分別轉染Huh7細胞，轉染24h後用熒光顯微鏡觀察熒光，可見Rev在熒光顯微鏡下發紅光，DDX3在熒光顯微鏡下發黃光;轉染48h後提取細胞總蛋白，透過Westernblot檢測Rev蛋白和DDX3的表達，凝膠成像儀成像結果證明重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag質粒能在Huh7細胞中表達相應的蛋白。

　　2.3DDX3對細胞HCV複製的影響重組pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag和pCDNA3.1-JFH1質粒共轉染Huh-7細胞，48h後用TRIzol法提取細胞總RNA，qPCR檢測HCV的複製水平，進行對照組與實驗組的兩獨立樣本t檢驗。結果表明，瞬時轉染DDX3和HCV複製質粒後，HCV的複製水平(1.09×107±0.18×107)明顯高於HCV複製質粒單獨轉染後的HCV複製水平(4.79×106±1.24×106)(P=0.03)。提示，DDX3可以增強HCV在細胞中的複製。

　　2.4Rev和DDX3共同作用對細胞HCV複製的影響重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag和pCDNA3.1-JFH1質粒共轉染入Huh-7細胞中，轉染48h後，提取細胞總RNA，進行qPCR檢測HCV的複製水平，進行對照組與實驗組的兩獨立樣本t檢驗。結果表明，Rev、DDX3和HCV複製質粒共轉染Huh-7細胞後，HCV的複製水平(1.74×107±0.40×107)明顯低於HCV單獨轉染後的HCV複製水平(4.17×107±0.46×107)(P<0.001)。Rev蛋白和DDX3共同作用可以抑制HCV的複製。

　　3討論

　　有研究證實迴圈血液中的HIVgp120蛋白在與肝細胞表面CCR5和CXCR4接觸後可啟用肝細胞內TGFβ-1表達從而促進肝細胞內HCV的複製。有研究發現可以從CD4-CXCR4+的原代肝細胞中成功分離出HIV;並且Fromentin證實CD4-CXCR4-的某些肝癌細胞株也可以感染HIV。證明HIV和HCV可共感染同一肝細胞，表明二者有產生直接作用的可能。在HIV、HCV共感染的患者中，HIV可以促進HCV的複製，而且加速肝纖維化的程序。HIV合併HCV感染患者與HIV單獨感染患者比較，肝臟相關疾病是非AIDS引起死亡的主要原因。最新的研究表明，HIV和HCV合併感染加速疾病的程序，特別是HIV感染增加HCV的複製、肝細胞凋亡、腸道微生物的移位、損傷HCV的特異性免疫應答。對HIV合併HCV的患者分別進行HIV的抗病毒治療和HCV的抗病毒治療，結果表明抗病毒治療有效的'延緩了肝纖維化的程序並減少了HIV合併HCV感染的患者終末期肝病的併發症。然而HIV合併HCV感染的患者接受常規的PEG-IFN聯合利巴韋林治療所產生的持續性病毒學應答要比單獨HCV患者有明顯的降低。

　　有研究表明，在HIV-1致病過程中，Rev蛋白髮揮著重要作用，其可以促進HIV-1病毒顆粒的產生，並可以抑制病毒所有調節蛋白的產生。因HIV和HCV在細胞複製中無法自身合成RNA解旋酶，其在細胞中的複製需要細胞內的RNA解旋酶參與。DDX3屬於DEAD解旋酶家族，DDX3參與多種細胞程序，包括mRNA的剪接和轉錄、翻譯的起始和RNA的轉運。有研究顯示，DDX3可以與HIV-1中的Tat蛋白作用，刺激病毒mRNA的翻譯，也可以和Rev蛋白作用參與REV-RRE介導的輸出作用。有研究表明DDX3與HCVCore蛋白結合促進HCV的複製。同時也有學者發現HIV-1Rev蛋白可與DDX3結合在核膜上形成複合體從而影響細胞質內DDX3的水平。也有研究發現Rev蛋白可以與HCV5’-UTR作用直接促進HCV的複製。但是尚未有研究證實Rev可以透過間接作用影響HCV的複製，也沒有研究證實Rev蛋白和DDX3共同作用對HCV的影響。

　　本研究證實pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag可以在真核細胞中表達;轉染後48hqPCR檢測發現，DDX3單獨與HCV作用時，可以促進HCVRNA的複製;當Rev和DDX3共同作用於HCV時，可以有效抑制HCVRNA的複製。可能原因:①Rev和DDX3在細胞中結合形成複合物，降低了細胞內DDX3的水平，降低了DDX3對HCVRNA的複製作用，從而競爭性抑制了DDX3對HCV複製的影響;②也有可能透過抑制某些訊號通路從而影響HCVRNA的複製，因為Rev和DDX3不僅在HCV的表達中起作用，而且參與細胞中的多種訊號通路，Rev和DDX3形成複合物後也抑制了相應的訊號通路，導致HCVRNA的表達量下降;③或者改變了Rev和DDX3在細胞中的分佈，導致它們無法在指定的作用位點與HCV進行相互作用，從而導致HCVRNA表達量的下降。