談丹蔞片對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制論文
談丹蔞片對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制論文
再灌注治療能快速開啟堵塞血管、恢復冠脈血供，是治療冠心病急性心肌梗死的重要手段，據統計我國2013 年冠狀動脈經皮介入術( percutaneouscoronary intervention，PCI) 的病例數超過40 萬例，位居世界第2 位。但再灌注治療只是一種區域性治療，並不能終止冠心病的病理發展程序，加之治療後出現的一系列心肌缺血再灌注損傷( myocardialischemia reperfusion injury，MIRI) ，嚴重製約了冠心病的治療效果。有研究證實，急性心肌梗死( acutemyocardial infarction，AMI) 患者即使接受最佳的再灌注治療，仍有10% ～ 30%出現MIRI，MIRI 被認為是導致心梗後心力衰竭發生率高達25% 及年死亡率達10% 的主要原因，因此防治MIRI 是臨床亟需解決的問題。動物實驗發現內皮功能障礙、脂質氧化損傷、炎症反應、鈣超載及能量代謝等在MIRI的發生發展中起重要作用。
MIRI 目前臨床尚缺乏有效的干預藥物，中醫藥具有作用通路廣泛、作用靶點多樣的特點，在臨床應用中具有獨到的優勢。丹蔞片是痰瘀同治的上市藥物，臨床用於治療各類冠心病心絞痛，臨床療效良好，目前關於丹蔞片的實驗研究大都針對心肌梗死後對心臟的保護作用，而對MIRI 後心髒保護作用的研究鮮有報道。課題組前期實驗研究發現，丹蔞片能降低大鼠心肌缺血程度，增加離子轉運通道相關酶活性，減少短暫心肌缺血再灌注誘導的致命性及非致命性室顫發生率、室性心動過速及室性早搏的發生頻率及持續時間。在此基礎上，為闡明丹蔞片對已有心肌不可逆壞死的心肌缺血再灌注治療後的心臟保護作用，本研究觀察其對大鼠心肌壞死程度及心臟射血分數的影響，並從內皮功能保護、抑制脂質過氧化及細胞凋亡方面探討其作用機制，為擴大丹蔞片的臨床應用範圍提供資料支撐。
1 材料
1. 1 動物清潔級雄性健康Wistar 大鼠80 只，體重( 300 ± 20) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK( 京) 2012-0001，在中國中醫科學院廣安門醫院動物中心適應性餵養3 d。
1. 2 藥品及試劑丹蔞片( 吉林康乃爾藥業有限公司，國藥準字Z20050244) ; 羧甲基纖維素鈉，2，3，5-氯化三苯基四氮唑( TTC) ，伊文思藍，水合氯醛( 國藥集團化學試劑有限公司，批號分別為20081023，20140507，20140228，20130201) ; 乳酸脫氫酶( LDH) 試劑盒，肌酸激酶同工酶( CK-MB) 試劑盒( 貝克曼庫爾特實驗系統有限公司，批號分別為AUZ1443，OSR61155) ; 大鼠內皮素( ET) 試劑盒( 北京北方生物技術研究所，批號S20083014) ; 大鼠一氧化氮( NO) ，丙二醛( MDA) 及髓過氧化物酶( MPO) 試劑盒( 南京建成生物工程研究所，批號分別為A012，A003-1，A044 ) ; Protease inhibitorcocktail( Roche 公司，批號11684817910) ; 蛋白免疫印跡法( Western blot) 抗體含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶( Caspase) -3，B 細胞淋巴瘤-2( Bcl-2) 及Bcl-2相關X 蛋白( Bax) ( CST 公司，批號分別為12768，2772， 2870) ; β-肌動蛋白( β-actin) 抗體( 中杉金橋公司，批號TA-09 ) ; DNA 斷裂的原位末端標記法( TUNEL) 反應液( Roche 公司，貨號11684817910) 。
1. 3 主要儀器RM6240BD 型多通道生理訊號採集處理系統，HX-300 型小動物呼吸機( 成都泰萌科技有限公司) ; Pro Sound 5000 SSD-SV B 型超聲儀( 日本Aloka 株式會社ALOKA 醫用儀器有限公司) ; AU640 型全自動生化分析儀( 美國Olympus 公司) ; Image Pro Plus 6. 0 影象分析系統軟體( 美國Media Cybernetics 公司) ; UV-2000 型紫外分光光度計( 上海尤尼柯公司) ; TGL-16 型臺式高速冷凍離心機( 長沙湘儀離心機儀器有限公司) ; SPR-960 型全自動酶標儀( 美國Thermo 科技公司) ; VE186 型小型高通量垂直電泳槽VE180 及轉移電泳槽( 上海天能公司) 。
2 方法
2. 1 分組及給藥大鼠按體重隨機分為假手術組、模型組、丹蔞片組，假手術組22 只，模型組30 只，丹蔞片組28 只，預防性給藥7 d，然後進行造模手術。其中假手術及模型組均以0. 5%的羧甲基纖維素鈉灌胃，根據文獻丹蔞片給藥劑量選擇0. 9 g·kg - 1，丹蔞片研碎後溶於0. 5%羧甲基纖維素鈉製成混懸液，灌胃體積為10 mL·kg - 1。
2. 2 模型建立以10% 水合氯醛腹腔注射麻醉，經口腔行氣管插管，連線小動物呼吸機，呼吸頻率約70 次/min，潮氣量7 ～ 8 mL，呼吸比1 ∶ 3，連線多通道生理訊號採集系統，描記術前Ⅱ導聯心電圖。於左側第3 或第3 肋間切口，鈍性分離皮下組織及肌肉，開啟心包膜，在左心耳下緣距肺動脈弓根部2 mm處結紮( 3 /8 圓針) ，進針深度約1 mm，寬度約2 mm，在冠脈前降支面置矽膠管連同冠脈用4 號醫用縫合線一起結紮。50 min 後，剪去結紮線，連同矽膠管一同取出，進行再灌注。假手術組只在相應部位穿線不結紮。關閉胸腔，逐層縫合肌肉、皮膚，術後腹腔注射青黴素10 萬單位預防感染。結紮成功標誌: 結紮下方心肌顏色變灰白，同時心電圖ST 段進行性抬高甚至弓背向上( 較正常至少抬高2 mm) 。復灌成功標誌: 心臟顏色由灰白逐漸恢復正常，或30 min 內心電圖ST 下降至少50%。造模前心率<350 次/min 者，未到規定時間死亡者及造模不成功者予以剔除。
2. 3 標本採集及指標檢測
2. 3. 1 再灌注2 h 心肌酶、內皮功能檢測每組取6 只大鼠，採集血清，以全自動生化分析儀檢測LDH及CK-MB，以放射免疫法檢測血清ET-1，紫外分光光度計檢測血清NO 水平，紫外分光光度計檢測心肌MDA，MPO 水平。
2. 3. 2 心肌梗死麵積測定未取血大鼠於再灌注48 h 時處死，術前與取材前B 超檢測心臟射血分數，從大鼠左肺靜脈注射0. 5%依文思藍約1. 5 mL，待大鼠口唇爪甲變藍後摘取心臟，以冰鹽水沖洗，擦乾，置於- 20 ℃凍存20 min 後，沿結紮線以下切成等厚的4 ～ 5 片，放入1% TTC 溶液中，37 ℃ 孵育15 ～ 20 min，流水沖洗。非缺血區呈藍色，缺血未梗死區呈磚紅色，缺血區( area at risk，AAR) 為灰白區與磚紅色區域之和，梗死區( area of necrosis，AN) 呈灰白色，放置於10%甲醛中室溫固定24 h。然後用L2035AW Pioneer 數碼照相機進行影象採集，以Version 6. 0 Media Cybernetics Image-Pro Plus 影象分析軟體分別計算出梗死區、佔缺血區面積的比例，缺血區佔左室面積的比例。
2. 3. 3 Western blot 法檢測心肌Caspase-3，Bax 及Bcl-2 蛋白表達每組取6 只大鼠分別檢測心肌Caspase-3，Bax 及Bcl-2 蛋白表達。根據試劑說明書提取蛋白，BCA 法檢測組織蛋白濃度，調整蛋白濃度，上樣，根據蛋白目的分子量設定電泳條件，轉膜，封閉，經一抗( 1 ∶ 1 000) ，二抗孵育，顯色曝光，將顯色後的圖片掃描後，使用Gel Image system ver. 4. 00軟體( 上海天能科技有限公司) 對影象進行灰度分析。以目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值表示目的.蛋白相對錶達量。
2. 3. 4 TUNEL 法檢測細胞凋亡每組取6 只大鼠做心臟石蠟切片，脫水，蛋白酶K 中孵育後避光條件下加稀釋液，TUNEL 反應液，37 ℃放置1 h 轉化converter-POD( POD) ，37 ℃ 烤箱中放置30 min，取出沖洗後加DAB，經蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯溶液透明，封片。於光學顯微鏡下觀察，其中正常心肌細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈現出深淺不一的棕褐色。每張切片於凋亡細胞分佈相同區域隨機選取5 個高倍視野，計算平均每個視野中的凋亡細胞數佔總細胞數的百分比，即為凋亡指數。
2. 4 統計學處理
採用SPSS 17. 0 統計軟體。計量資料結果以珋x ± s 表示，多組間比較採用單因素方差分析，P < 0. 05 為差異有統計學意義。
3 結果
3. 1 丹蔞片對再灌注2 h 心肌酶的影響與假手術比較，模型組及丹蔞片組LDH 及CK-MB 均顯著升高( P < 0. 01) ; 與模型組比較，丹蔞片組LDH 及CK-MB 均明顯降低( P < 0. 05) 。
3. 2 丹蔞片對再灌注2 h 內皮功能的影響與假手術比較，模型組血清ET-1 顯著上升( P < 0. 01) ，NO 明顯下降( P < 0. 05) ; 與模型比較，丹蔞片組ET-1 明顯下降( P < 0. 05) ，而NO 明顯上升( P<0. 05) 。
3. 3 丹蔞片對再灌注2 h 心肌組織氧化損傷的影響與假手術組比較，模型組MDA 及MPO 均顯著升高( P < 0. 01) ; 與模型組比較，丹蔞片組MDA 及MPO 明顯降低( P < 0. 05) 。
3. 4 丹蔞片對再灌注48 h 心臟射血分數及心肌梗死麵積的影響與假手術組比較，模型組及丹蔞片組大鼠EF 值顯著下降( P < 0. 01) ; 與模型組比較，丹蔞片組大鼠EF 值明顯上升( P < 0. 05) 。假手術組無心肌梗死; 與模型組比較，丹蔞片組心梗/缺血面積比率顯著下降( P < 0. 01) 。
3. 5 丹蔞片對再灌注48 h 心肌細胞凋亡指數影響與假手術比較，各組心肌凋亡指數均有顯著升高( P < 0. 01) ; 與模型組比較，丹蔞片能顯著降低心肌凋亡指數( P < 0. 01) 。
3. 6 丹蔞片對再灌注48 h 心肌Caspase-3，Bax 及Bcl-2 的蛋白表達的影響與假手術比較，模型組及丹蔞片組Caspase-3 表達明顯升高( P < 0. 05，P<0. 01) ; 與模型比較，丹蔞片組Caspase-3 表達顯著降低( P < 0. 01) 。與假手術比較，模型組及丹蔞片組Bax 表達明顯升高( P < 0. 05，P < 0. 01) ; 與模型比較，丹蔞片組Bax 表達顯著降低( P < 0. 01) 。與假手術比較，模型組及丹蔞片組Bcl-2 表達顯著降低4 討論MIRI 在臨床可表現為再灌注心律失常，心肌無複流現象及心肌頓抑等，此類患者預後不良，心力衰竭、心源性猝死等發生機率較高。其發生機制複雜，至今還未完全明確，綜合以前研究結果認為，氧自由基損傷、炎症反應、內皮功能障礙、鈣超載等在MIRI 過程中相互影響，對心肌造成巨大損害。其中內皮功能障礙是動脈粥樣硬化發生發展的始動環節，更是貫穿心肌缺血及再灌注損傷的全過程。內皮損傷後其分泌功能障礙，擴血管物質NO 減少，破壞了與縮血管物質ET 間的動態平衡，一方面內皮損傷促進血管收縮心肌缺血進一步加重; 另一方面造成內皮細胞的屏障作用破壞，為中性粒細胞和單核細胞及炎性細胞物質的浸潤提供了場所，間接加重炎症反應。此外MIRI 發生時，缺血區心肌神經末梢釋放大量兒茶酚胺，被單胺氧化酶分解後產生大量氧自由基( OFR) ，超過機體的清除能力，引發鏈式脂質過氧化反應，損傷細胞膜、細胞器乃至細胞核心酸，進而導致細胞凋亡甚至壞死，OFR對組織的損傷要遠遠大於缺血本身造成的損傷。心肌細胞凋亡是MIRI 的最終環節，心肌缺血20 ～30 min 即可發生壞死並且具有不可再生的特性，故壞死周圍的瀕死心肌是臨床治療上爭取的物件，阻止壞死周邊心肌細胞凋亡成為治療MIRI 的關鍵病理基礎，文中提到的氧自由基、炎症因子、鈣超載等共同對心肌細胞造成損傷導致細胞凋亡。Bax 和Bcl-2 是一對調節細胞凋亡的基因，Bax 促進細胞凋亡而Bcl-2 可抑制細胞凋亡，啟用下一級Caspases酶系引起細胞的凋亡。其中Caspase-3 是細胞凋亡的主要執行者，活化後可分解細胞內的重要蛋白及底物，進而導致細胞凋亡。
本研究發現，丹蔞片在再灌注損傷發生的早期能促進MIRI 後內皮細胞NO 的釋放，抑制縮血管物質的釋放，修復受損的內皮分泌功能。MDA 反應體內自由基的多少，MPO 反應體內中性粒細胞的活動程度，丹蔞片能抑制心肌組織中MDA 及MPO 生成，改善自由基及炎症細胞對心肌的損傷。此外，丹蔞片在減少心肌梗死麵積的同時還能有效阻止MIRI後心髒射血分數的下降趨勢。有臨床研究證實，低EF 值冠心病患者在冠脈旁路移植術前，應用主動脈內球囊反搏術可改善心功能後，能減少術後心梗、低心排血量等嚴重併發症的發生並能降低圍術期病死率。另對擇期PCI 的患者進行研究發現，白細胞計數，C 反應蛋白( CRP) 升高與EF 值降低有關，提示丹蔞片改善心臟EF 值可能與降低炎症反應的作用有關。本研究結果顯示，丹蔞片可抑制心肌促凋亡蛋白Bax，Caspases-3 的表達，提高抑制凋亡基因蛋白Bcl-2 的表達，丹蔞片可能透過抑制細胞凋亡保護梗死區周圍的心肌，從而降低心肌梗死區與缺血區比例，保護再灌注損傷的心臟。現代藥理研究表明，丹蔞片成分中黃芪、丹參、葛根、川芎等諸多藥物提取物均有廣泛的心血管效應，採用生物資訊學方法推測它們可能透過環加氧酶2，瘦素蛋白，一氧化氮合酶3 及低密度脂蛋白受體起作用，但尚缺乏相關實驗驗證，這些已知化學成分協同作用於心血管系統，從多途徑、多靶點發揮MIRI 後對心臟的保護作用。
丹蔞片具有活血化痰、寬胸通陽之效，在臨床應用中對穩定型心絞痛、支架植入術後患者及非血運重建急性冠脈綜合徵患者均有確切的療效，亦有臨床研究表明丹蔞片具有一定的降血脂和穩定斑塊作用，加之其降血壓和減慢心率的作用共同組成緩解臨床症狀的基礎。MIRI 是一個複雜的病理過程，心肌細胞壞死及凋亡是心肌組織學損害的最終結果，該過程有大量訊號通路參與，損害通路和救助通路交織成網狀。本實驗探索了丹蔞片治療MIRI 機制，至於其對訊號通路及其相關調控蛋白基因的影響有待於進一步研究，明確其作用機制，為丹蔞片防治MIRI 提供基礎資料和實驗支撐。