淺談基因工程在番茄抗旱方面的作用論文

　　摘要：番茄抗旱性是由許多微效基因座和數百個影響乾旱形態和生理反應的基因控制的, 闡明番茄抗旱的分子機制、開發分子標記輔助選擇將有助於加速培育具有抗旱性的番茄新品種。本文概述了番茄抗旱分子機制的研究進展、番茄在乾旱條件下的形態特徵變化和抗旱育種, 重點闡述了番茄抗旱性基因工程改良方面的研究進展, 為進一步應用現代生物技術進行植物抗旱性基因工程改良和分子標記輔助選擇育種提供方法和思路。

　　關鍵詞：番茄; 抗旱; 育種; 基因工程; 綜述;

　　中國人口眾多, 農業生產所用的淡水資源十分匱乏, 人均僅有2 200 m3, 是全球人均淡水資源最貧乏的國家之一 (王海波, 2011) 。乾旱缺水在眾多非生物脅迫中是最具破壞性的, 同時也是限制作物產量和品質的一個重要影響因素 (Tuberosa&Salvi, 2006) 。其中生殖生長期受乾旱影響最大, 在生殖階段乾旱脅迫可以直接導致作物的產量損失大於50% (Boyer, 1982) 。

　　乾旱脅迫通常伴隨著熱脅迫或其他脅迫, 植物使用多種策略來響應乾旱脅迫並且透過多種訊號級聯和滲透調節等形態和生理改變以適應乾旱。Levitt (1981) 認為, 植物適應乾旱的機理可分為避旱、御旱和耐旱, 並且將御旱性和耐旱性統稱為抗旱性。避旱即植物在乾旱來臨之前加速發芽, 縮短生命週期以避免乾旱脅迫;御旱即植物在乾旱初期, 脅迫尚不嚴重時, 透過改變地上部和根系性狀以減少水分損失, 維持較高的水勢, 以應對乾旱脅迫;耐旱即植物演變出一系列的緩解機制如積累滲透保護劑, 防止細胞內水分散失;產生脅迫感應訊號, 抗氧化劑和活性氧 (ROS) 清除劑;降低光合酶活性以降低光合作用等生理生化反應, 在嚴重乾旱脅迫下維持細胞結構的穩定性。儘管已經有一些策略能夠提高植物的抗旱性, 但由於抗旱性狀的生理和遺傳複雜性, 在改善抗旱性或開發抗旱品種方面進展緩慢。

　　番茄 (Solanum lycopersicum L.) 是全世界栽培最廣泛的蔬菜作物之一, 全球番茄產量達到1.6億t, 其中超過30%產自中國 (聯合國糧農組織,同時, 番茄也是植物科學研究的重要模式植物之一。番茄原產地在南美洲熱帶地區, 屬於需水量較多的一種蔬菜作物, 環境脅迫中乾旱脅迫是限制番茄產量和品質的主要制約因素 (柏成壽和陸幗一, 1991) 。因此選育抗旱性強的番茄品種是重要的育種目標。目前, 主要透過常規育種、生物技術或兩者結合的方法改良植物的抗旱性。近年來, 諸多學者圍繞著番茄抗旱性做了大量頗具價值的研究工作, 為番茄抗旱性的改良奠定了基礎。

　　1 乾旱對番茄形態特徵的影響

　　1.1 乾旱對番茄根系的影響

　　根系發育直接受環境因素的影響, 擁有一個健壯的根系對於提高作物的抗旱性非常重要。最具代表性的智利番茄 (S.chilense) 生長在世界上最乾旱的地區, 其發達的根系能夠促進植株吸收深層土壤的水分 (Chetelat et al., 2009) 。Champoux等 (1995) 認為, 水稻根系厚度、根系表面積、每分櫱根幹質量、最大根深度和根/莖比均與田間抗旱性呈正相關。楊再強等 (2016) 發現, 在乾旱脅迫時土壤中番茄的淺層根系會減少, 根系深扎、根表面積增加, 然而隨著乾旱脅迫的加劇, 植物正常的生長機制遭到破壞, 導致根長、根表面積和根尖數等降低, 根系的正常生長受到顯著抑制。

　　1.2 乾旱對番茄葉片的影響

　　水分脅迫或其他逆境訊號會誘導多種離子進出保衛細胞, 造成保衛細胞內成分發生變化, 從而導致保衛細胞形態改變, 造成氣孔關閉、卷葉、植物的蒸騰速率降低, 與植物抗旱性有關的葉片性狀包括葉片形狀 (卷葉) 、角質層、氣孔密度、氣孔孔徑、葉片滲透調節等。

　　Kadioglua等 (2012) 發現, 水稻、玉米、小麥和高粱等作物的葉片適度捲曲可以改變植物葉片結構, 增強光合作用, 透過減少水分蒸發流失延遲衰老並增加冠層光透射。當乾旱脅迫嚴重時, 透過誘導並加速植物葉片的衰老來減少綠葉面積, 從而減少蒸騰和水分的消耗 (安玉豔和梁宗鎖, 2012) 。但是在作物生產中, 乾旱脅迫引起的葉片衰老, 導致乾旱解除後作物冠層面積的'減少和光合同化能力的降低, 進而引起整株早衰並最終導致作物產量和品質的下降 (Rivero et al., 2007) 。

　　氣孔在控制植物蒸騰失水、降低葉片表面的高溫、吸收CO2進行光合作用以及促進植物生長方面扮演著極其重要的角色 (Damour et al., 2010) 。番茄氣孔大部分集中於葉片下表皮, 葉片下表皮的氣孔密度遠遠大於上表皮;隨著土壤水分虧缺強度的增加, 葉片上表皮氣孔密度逐漸增大, 而下表皮氣孔密度呈現先減小後增大的趨勢 (劉朝霞, 2016) 。潘那利番茄 (S.pennellii) 葉片表皮具有較多氣孔, 可吸收和利用空氣中的水分, 並且葉片上有豐富的蠟質, 可以降低乾旱情況下的水分喪失, 對乾旱脅迫具有明顯的耐受性 (Chetelat et al., 2009) 。

　　2 番茄抗旱性育種的研究進展

　　種質資源是育種的基礎。由於番茄是一種嚴格的自花授粉植物, 經過長期的馴化和選育, 番茄的遺傳背景逐漸變窄 (Rick, 1986) 。因此, 透過廣泛的育種策略豐富番茄的種質資源對番茄育種極其重要。研究人員正努力透過常規育種技術、分子輔助育種和轉基因技術等育種方法獲得抗旱性強的番茄品種。

　　2.1 番茄抗旱性基因工程改良研究進展

　　轉基因技術能夠打破物種界限、克服生殖障礙, 把重要的抗旱基因整合到品種中, 能夠快速、有效地改良作物的抗旱性。植物為了適應乾旱脅迫, 進化出多個調節不同乾旱響應基因的互作訊號傳遞鏈, 這些乾旱響應基因用於產生在乾旱條件下起作用以增強植物抗性的蛋白質, 如轉錄因子 (TF) 、酶、分子伴侶和其他功能性蛋白等。目前, 已經有很多基因透過超量或抑制表達來檢測基因在植物抗旱中的作用, 並且取得了很大的進展, 這些在抗旱中有功能的基因不但可以直接改良植物的抗旱性, 也可以開發標記, 為分子標記輔助選擇 (MAS) 育種奠定基礎。

　　2.1.1 抗旱相關轉錄因子

　　植物鹼性亮氨酸拉鍊蛋白 (b ZIP) 、乾旱響應元件結合蛋白 (DREB) 、NAC和鋅指 (Zinc finger) 蛋白等編碼多種TF家族成員, 能夠提高植物抗旱性 (Yamaguchi-Shinozaki&Shinozaki, 2006;Ariel et al., 2007;Ciftci-Yilmaz&Mittler, 2008;Fang et al., 2008) , 這些TF基因的異位表達或抑制可能啟用多種脅迫耐旱機制。

　　植物的b ZIP轉錄因子能透過參與脫落酸 (ABA) 訊號轉導途徑, 調控植物對乾旱脅迫的反應。Orellana等 (2010) 研究Sl AREB1在番茄中的功能作用時, 將Sl AREB1基因在番茄中超量表達, 轉基因番茄植株顯著提高了對乾旱和高鹽脅迫的耐受性, 同時大規模基因表達分析顯示Sl AREB1能夠上調與高鹽、乾旱和氧化應激相關基因的表達。

　　一些DREB/CBF基因在ABA獨立的乾旱響應過程中起重要作用, 並且透過分離和鑑定該家族的很多成員發現, 它們能夠改良植物的抗旱性。首先在擬南芥中發現DREB (包括兩個亞類:DREB1和DREB2) 在乾旱脅迫中起作用 (Liu et al., 1998) 。將擬南芥的At CBF1轉錄因子在rd29A啟動子的控制下, 在番茄中異源表達, 能夠顯著提高轉基因番茄植株對乾旱脅迫的耐受性, 並且植株正常生長 (Singh et al., 2011) 。然而Li等 (2012) 研究發現, 當SIDREB基因在番茄中超量表達時, 由於合成赤黴素的關鍵基因下調錶達, 導致轉基因番茄葉片擴大和節間伸長受到限制, 從而造成矮小的表型, 由此提高了轉基因番茄的抗旱性。

　　NAC由NAM、ATAF和CUC組成, 屬於植物特有的TF家族, 番茄中共有102條NAC蛋白, 這個家族的部分基因參與植株對病原體、病毒感染和環境刺激的反應 (Souer et al., 1996;Nuruzzaman et al., 2013) 。Liu等 (2014) 研究發現, 將NAC轉錄因子Sl SRN1沉默能夠增加轉基因番茄對生物脅迫的敏感性, 如因灰葡萄孢菌、丁香假單胞菌而感染疾病, 但會提高轉基因番茄對氧化、高鹽、乾旱脅迫的耐受性。Sl NAC4調控乾旱和高鹽的相關基因表達, 在番茄抗旱過程中起著很重要的作用 (Zhu et al., 2014) 。由此, NAC蛋白可以作為功能基因資源, 用於改善植物對生物和非生物脅迫的耐受性 (Nakashima et al., 2012;Puranik et al., 2012) 。

　　其他轉錄因子, 如乙烯響應因子 (ERF) 不僅能夠促進植物種子萌發、果實成熟、器官脫落、病原體反應和衰老, 還能夠參與植物脅迫反應 (Narayana, 1991) ;並且其他研究還證明, ERF的TF家族參與植物脅迫反應 (Lorenzo et al., 2003) 。Klay等 (2014) 研究發現, 屬於番茄ERF家族的轉錄因子Sl-ERF.B.3基因在乾旱以及鹽分脅迫下被下調錶達, 但有趣的是低溫、高溫脅迫會誘導其表達。超量表達1個番茄的WRKY轉錄因子Sl WRKY39, 顯著提高了番茄的抗旱能力 (Sun et al., 2015) 。番茄的1個SR/CAMTA轉錄因子Sl SR1和Sl SR3L負向調控番茄的抗病能力, 但是正向調控番茄的抗旱性 (Li et al., 2014a) 。

　　2.1.2 氧化調控相關基因

　　活性氧 (ROS) 會導致脂質過氧化、蛋白質和核酸的變性等, 可透過抑制ROS積累以減輕乾旱脅迫, ROS的清除是由一系列酶和非酶抗氧化劑以及有機化合物完成的 (Gill&Tuteja, 2010) 。

　　過氧化氫酶 (CAT) 是一種抗氧化酶, 屬於ROS清除劑, 負責將H2O2分解成水和氧氣, 以維持植株體內活性氧的平衡。將源自大腸桿菌的過氧化氫酶 (cat E) 基因引入番茄的葉綠體後, 轉基因株系對過氧化氫具有更高的親和性, 並且轉基因番茄中cat E基因過表達不僅能夠提高因冷脅迫或乾旱脅迫而引起的氧化損傷的耐受性, 還能夠提高由除草劑百草枯引起的氧化應激的耐受性 (Mohamed et al., 2003) 。

　　在高等植物中, 超氧化物歧化酶 (SOD) 作為抗氧化酶和ROS的清除劑, 負責催化超氧自由基產生的O2和H2O2。在植物細胞中根據酶的活性位點上具有不同的金屬 (Fe2+、Mn2+和Cu2+) , 以及它們在亞細胞定位中不同的位置 (細胞質、線粒體、過氧化物酶體和葉綠體) , 將其分為幾種SOD異構體 (Wang et al., 2007;Aydin et al., 2014) 。如Mn SOD基因在番茄植株中的過表達能提高對高鹽和乾旱脅迫的抗性, 且降低了電解質的滲透率, 這意味著Mn SOD能夠降低活性氧對轉基因番茄的損傷 (Wang et al., 2007) 。

　　葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (G6PDH) 在戊糖磷酸途徑中首先氧化葡萄糖-6-磷酸 (G6P) , 是該反應的限速酶, 並且能夠產生大量的NADPH。G6PDH活性增強能夠為抗氧化系統提供NADPH, 以去除過量的ROS, 保護細胞膜的穩定性 (Santo et al., 2012) 。G6PDH啟動子中具有不同的ABA響應元件, 其表達部分是由於ABA的誘導 (Cardi et al., 2011) 。G6PDH在乾旱條件下與ABA合成相關的NCED, ABA訊號轉導因子PP2C, 參與脯氨酸合成的P5CS, 參與ROS清除的抗壞血酸過氧化物酶 (APX) 等其他乾旱相關基因均在番茄的應激反應中呈現顯著上調和活性增強, 並且在乾旱條件下呈現持續增長的狀態 (Landi et al., 2016) 。綜上所述, 乾旱誘導ABA合成和訊號傳導, 特異性啟用ABA應答基因, G6PDH則被特異地誘導, 以此滿足清除系統 (例如APX) 增加引起的增加還原劑的需求, 從而調節和穩定ROS的增量, 進而提高了植物的抗旱性 (Landi et al., 2016) 。

　　2.1.3 訊號傳導相關基因

　　當細胞壁首先感知非生物脅迫後會啟用涉及不同脅迫基因的訊號轉導 (Oliveira et al., 2014) 。轉錄後蛋白修飾如蛋白磷酸化/去磷酸化, 蛋白降解/修飾和第二信使的感應如Ca2+, 它們在脅迫訊號傳導和調節中發揮重要作用。一些TF和乾旱響應蛋白需要透過被磷酸化/去磷酸化或修飾等翻譯後調節以獲得活性, 例如編碼絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 、編碼CIPK蛋白激酶的基因、編碼鈣依賴蛋白激酶 (CDPK或CPK) 和編碼蔗糖非酵解型蛋白激酶鈣依賴蛋白激酶 (Sn RK) 等的基因都在乾旱脅迫訊號傳導和調節途徑中起作用。MAPK在耐受脅迫相關的訊號網路中起關鍵作用 (Huang et al., 2012) 。將植物暴露於各種非生物脅迫條件下時, MAPK參與ABA的調節過程 (Hirayama&Shinozaki, 2007) , Li等 (2013) 使用VIGS方法發現Sp MPK1、Sp MPK2和Sp MPK3基因透過影響ABA-H2O2途徑影響H2O2的產生和氣孔的運動來增強番茄的耐旱性。超表達Sl MPK7的轉基因番茄會積累較少的ROS、更多的脯氨酸和可溶性糖以及誘導脅迫響應基因表達, 提高轉基因番茄對非生物脅迫的耐受性 (Yu et al., 2016) 。CIPK和CDPK是兩種型別的Ca2+-敏感蛋白激酶, 據報道Md SOS2L1 (源自蘋果的CIPK激酶) 能夠增加番茄和蘋果中抗氧化代謝物的水平 (Hu et al., 2016) 。Sn RK是廣泛存在於植物中的一類Ser/Thr類蛋白激酶, 在植物抗逆生理過程中具有重要的作用, 例如在番茄中抑制表達Sl Sn RK2.1、Sl Sn RK2.2顯著提高了轉基因番茄對滲透脅迫的耐受性以及對氧化脅迫的耐受性, 番茄的耐鹽性和耐旱性明顯增強 (Yang et al., 2015) 。

　　2.2 番茄抗旱性常規育種的研究進展

　　番茄抗旱性的常規育種主要採用大規模回交策略獲得集親本優良性狀於一體的新品種, 獲得超越親本的雜交後代或者由基因互作產生親本不具備的新性狀型別, 開發具有改良抗旱性和具有高產潛力的新品種 (Slabbert et al., 2004) 。許多研究表明, 野生番茄及其近緣野生種中含有豐富的耐旱基因, 將這些攜帶優良耐旱基因的野生番茄與普通栽培種番茄雜交, 可以將雙親的優良性狀整合到一起, 從而育成耐旱性強的番茄材料或新品種。例如耐旱野生番茄S.pennellii和普通栽培種番茄S.lycopersicum cv.M82進行雜交, 雜交後代與M82進行回交, 在乾旱條件下後代的產量顯著高於親本 (Gur&Zamir, 2004) 。

　　由於常規育種是透過植株的表型性狀來推測抗旱性的基因型, 而抗旱性是由多個小的微效基因座控制, 且遺傳多樣性, 遺傳力低, 抗旱性相關性狀的基因型-環境相互作用水平較高, 所以番茄抗旱育種中常規育種的進展仍然相當緩慢。隨著現代生物技術的迅速發展, 人們開始利用分子生物學手段進行植物抗旱性分子改良研究。在利用基因工程改良番茄抗旱性的同時, 分子標記輔助選擇 (MAS) 技術也應用到改良作物抗旱育種實踐中。採用MAS技術能夠追蹤調控抗旱性狀的遺傳位點, 免去多年的大量田間測試工作, 提高選擇效率, 同時高解析度的遺傳圖譜和物理圖譜建成之後, 就可以透過圖位克隆技術分離抗旱相關基因, 研究抗旱基因的功能。同樣, 標記輔助回交 (MABC) 的策略可以將抗旱供體基因型的主要數量性狀基因座 (QTL) 滲入高產但不抗旱或乾旱敏感的受體親本中, 以提高植物的抗旱性。

　　3 展望

　　番茄營養豐富, 風味獨特, 深受人們的喜愛。近年來我國番茄栽培面積不斷增加, 尤其是設施栽培。但是農業水資源匱乏是限制番茄生產的重要因素之一, 因此, 科學合理地進行番茄生產是眾多研究人員的目標。

　　在自然條件下, 乾旱脅迫的時節、強度和持續時間是高度動態和不可預測的, 這使得抗旱性研究複雜化。因此, 如果條件允許, 在評估抗旱時應與其他主要的非生物脅迫如高溫和高鹽聯絡起來, 因為乾旱脅迫經常伴隨高溫脅迫的發生, 並且植物在響應這些脅迫時會在多種水平上發生互動作用。

　　透過轉基因的方法已經分離和鑑定了許多與作物抗旱性相關的基因。然而, 檢測這些基因對番茄抗旱性的影響主要在溫室、小盆中或僅在幼苗期間進行, 只有少數在田間檢測。由於田間乾旱脅迫的複雜性, 那些溫室中對改良抗旱性有效的基因在用於育種程式之前必須在田間進行進一步評估。並且一些基因對作物正常生長或增產潛力會有負面影響, 例如植物在遭遇不利的環境時, 植株變得矮小, 減少能量或水分的流失以適應逆境。所以在番茄抗旱育種過程中, 在明確基因功能的基礎上, 還需要建立科學的抗旱評價體系。目前, 利用現代分子生物學和MAS結合的方法進行育種, 是提高番茄抗旱性的有效途徑。

　　基因組編輯也是一種精準、高效的基因工程方法。其中CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein) 系統只需合成1個sg RNA就能實現對基因的特異性修飾, 操作簡單。利用此係統將番茄的Sl MAPK3基因進行定點敲除, 番茄表現對乾旱高度敏感 (Wang et al., 2017) 。儘管關於基因編輯技術在番茄抗旱性方面的報道並不多, 但番茄具有高效的轉化方法、二倍體基因組、高質量的基因組序列以及極高的經濟價值, 在眾多雙子葉植物中是CRISPR/Cas9基因編輯技術的理想候選者 (Brooks et al., 2014) , 並且基因編輯技術能夠定向修飾基因, 能夠獲得不含轉基因痕跡的後代, 操作方便。因此基因編輯技術在改良番茄性狀、提高抗旱性方面極具潛力。

　　參考文獻

　　[1]安玉豔, 梁宗鎖.2012.植物應對乾旱脅迫的階段性策略.應用生態學報, 23 (10) :2907-2915.

　　[2]柏成壽, 陸幗一.1991.水分脅迫對番茄幼苗生長影響的研究.園藝學報, 18 (4) :340-344.

　　[3]劉朝霞.2016.土壤乾旱脅迫對番茄根系生長、氣孔特性及保護酶活性的影響[碩士論文].南京:南京資訊工程大學.

　　[4]王海波.2011.海水淡化用p H及電導率線上檢測系統研究[碩士論文].杭州:杭州電子科技大學.

　　[5]楊再強, 邱譯萱, 劉朝霞, 陳豔秋, 譚文.2016.土壤水分脅迫對設施番茄根系及地上部生長的影響.生態學報, 36 (3) :748-757.