克隆生物技術論文

　　克隆原指以幼苗或嫩枝插條，以無性繁殖或營養繁殖的方式培育植物，如扦插和嫁接。下面是小編為大家精心推薦的克隆生物技術論文，希望能夠對您有所幫助。

　　豬USF1基因克隆與序列分析

　　摘要：研究克隆了豬USF1基因1 382 bp的cDNA序列(登入號：EF 219407)和5 516 bp的DNA序列(登入號：EF 625885)。序列分析發現豬USF1基因編碼區序列與人、小鼠的同源性分別為99%和98%。基因組序列分析發現豬USF1基因包含11個外顯子和10個內含子，內含子的剪接方式均符合“GT-AG”法則。

　　關鍵詞：豬;USF1基因;克隆;序列分析

　　中圖分類號：S828;Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114(2013)24-6175-03

　　上游刺激因子1(Upstream stimulatory factor 1，USF1)是螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鍊(HLH- LZIP)轉錄因子家族成員之一[1]，可以與USF2形成二聚體，並能識別DNA的E-box序列，調節基因轉錄[2]。人類USF1基因位於1q22-q23[3]，並廣泛表達於機體的各個組織，調控糖和脂肪代謝基因的表達[4]，此外USF1基因還具有調節免疫反應和細胞週期的功能[5]。研究發現USF1基因可以作為調節治療人的胰島素抵抗葡萄糖不耐症、II型糖尿病和向心型肥胖易感症的候選基因[6-9]。本研究利用EST資訊和測序的方法克隆了豬USF1基因並進行了序列分析，為進一步研究該基因對豬生長髮育的調控機理具有重要的意義。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　採集4月齡大白豬(湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所原種豬場)的肌肉組織，用液氮速凍置於

　　-70 ℃中，利用TRizol法提取總RNA，反轉錄得到cDNA。利用DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA，貯存於-20 ℃。

　　pMD-18T vector system、DH5α購自寶生物工程(大連)有限公司;Gel Extraction Kit購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

　　1.2 引物設計

　　以人的基因序列為探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank資料庫中搜索同源序列，篩選豬的同源性EST(標準：長度≥200 bp，相似性≥80%)，用DNAStar軟體包中的SeqMan程式進行EST序列拼接，參照拼接的.contig(重疊群)採用Primer5.0軟體設計引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R等3對引物擴增USF1基因的cDNA序列。參照USF1基因的cDNA序列設計U4F/U4R，U5F/U5R，U6F/U6R，U7F/U7R，U8F/U8R，U9F/U9R等6對引物(表1)擴增USF1基因的序列。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

　　1.3 PCR擴增與測序

　　PCR擴增體系為25 μL，包括50 ng 模板DNA、2.5 mmol/L 1×Taq Buffer、1.5 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、0.5 mmol/L PCR primers、2 U Taq DNA聚合酶。PCR反應程式為：94 ℃預變性4 min; 94 ℃變性45 s，退火(溫度、時間根據引物來確定)，72 ℃延伸90 s，35個迴圈;最後72 ℃延伸10 min。PCR產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Gel Extraction Kit試劑盒純化回收，與pMD-18T vector system連線，並轉化大腸桿菌DH5α，將陽性克隆送至北京奧科生物技術有限公司測序。

　　2 結果與分析

　　2.1 RT-PCR擴增USF1基因

　　以大白豬cDNA為模版，利用引物U1F/U1R，U2F/U2R，U3F/U3R均擴增出了特異帶，RT-PCR擴增產物結果如圖1所示。將PCR產物回收、純化、克隆測序，測序結果顯示引物U1F/U1R擴增產物長度為613 bp(圖1a)，引物U2F/U2R擴增產物長度為312 bp(圖1b)，引物U3F/U3R擴增產物長度為520 bp(圖1c)。

　　2.2 豬USF1基因的cDNA序列同源性分析

　　利用DNAStar軟體的SeqMan程式將RT-PCR擴增得到的片段進行拼接，得到一條長1 382 bp的 cDNA序列。將獲得的豬USF1基因的cDNA序列分別與人USF1基因cDNA序列(NM_007122)和小鼠序列(NM_009480)進行比對。結果表明，豬與人、小鼠的同源性分別為99%和98%，確定所獲取的序列為豬的USF1基因，提交到GenBank，得到登入號為EF 219407。

　　2.3 豬USF1與部分物種USF1的進化關係

　　利用GenBank已有的USF1蛋白質序列： NP_001001161(USF1，Cattle)，NP_001007486(USF1， Gallus)，NP_009053(USF1，Human)，NP_033506 (USF1， Mouse)， NP_113965(USF1，Rat)以及豬USF1基因編碼的氨基酸序列，利用ClustalW軟體對6個物種的USF1氨基酸序列進行了序列比對，結果發現豬與人和牛的同源性達到了99%，與小鼠和大鼠的同源性達到了98%，並構建了系統進化樹(圖2)。

　　2.4 豬USF1基因組序列的克隆和序列分析

　　根據人的cDNA序列和人的基因組序列比對結果，預測的豬USF1基因內含子，參照分離得到的基因序列，設計U4F/U4R，U5F/U5R，U6F/U6R，U7F/U7R，U8F/U8R和U9F/U9R等6對引物，以大白豬基因組DNA為模板，PCR擴增豬USF1基因的10個內含子序列，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測結果如圖3。

　　引物U4F/U4R在豬基因組中的擴增片段長度是2 094 bp，其中第1內含子的長度為2 007 bp;引物U5F/U5R在豬基因組中的擴增片段長度740 bp，其中第2，3內含子的長度分別為363 bp和157 bp;引物U6F/U6R在豬基因組中的擴增片段長度783 bp，其中第4，5內含子的長度分別為301 bp和241 bp;引物U7F/U7R在豬基因組中的擴增片段長度600 bp，其中第6，7內含子的長度分別為249 bp和135 bp;引物U8F/U8R在豬基因組中的擴增片段長度656 bp，其中第8，9內含子的長度分別為153 bp和249 bp;引物U9F/U9R在豬基因組中的擴增片段長度690 bp，其中第10內含子的長度為192 bp。利用DNAStar軟體的SeqMan程式將擴增得到的片段進行拼接，得到一條5 516 bp的DNA序列，將序列拼接提交到GenBank收錄號為EF 625885。基因組序列分析發現豬USF1基因包含11個外顯子和10個內含子，內含子的剪接方式都符合“GT-AG”法則。 3 小結與討論

　　本研究中豬USF1基因的cDNA序列與人和小鼠的同源性分別為99%和98%;編碼區的高度保守性證實了所分離基因的正確性，同時也為利用小鼠等模式動物的基因資訊來進行畜禽基因組學的研究提供依據。

　　脊椎動物間的基因序列具有高度的保守性，根據已知物種的基因組序列，可以預測其他物種同源基因的基因序列。本研究利用人USF1基因序列，預測了豬USF1基因序列，並透過試驗獲得了相應的基因組序列。測序結果表明，所獲得的候選基因的內含子和外顯子組成及相對位置與預測結果一致，且內含子的剪接方式均符合“GT-AG”法則。

　　參考文獻：

　　[1] GREGOR P D， SAWADOGO M， ROEDER R G， et al. The adenovirus major late transcription factor USF is a member of the helix-loop-helix group of regulatory proteins and binds to DNA as a dimer[J]. Genes Dev，1990，4(10)：1730-1740.

　　[2] SIRITO M， WALKER S， LIN Q， et al. Members of the USF family of helix-loop-helix proteins bind DNA as homo- as well as heterodimers[J]. Gene Expression，1992，2(3)：231-240.

　　[3] SHIEH B H， SPARKES R S， GAYNOR R B， et al.Localization of the gene-encoding upstream stimulatory factor (USF) to human chromosome 1q22-q23[J]. Genomics，1993，16(1)：266-268.

　　[4] LEE J C， LUSIS A J， PAJUKANTA P. Familial combined hyperlipidemia： Upstream transcription factor 1 and beyond[J]. Current Opinion in Lipidology，2007，17(2)：101-109.

　　[5] TERRAGNI J， NAYAK G， BANERJEE S， et al.The E-Box binding factors Max/Mnt， MITF and USF1 Act coordinately with FoxO to regulate expression of Pro-apoptotic and cell cycle control genes by phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/GSK3 signaling[J]. Journal of Biological Chemistry，2011，286(42)：36215-36227.

　　[6] PAJUKANTA P， LILJA H E， SINSHEIMER J S， et al.Familial combined hyperlipidemia is associated with upstream transcription factor 1(USF1)[J].Nature Gene，2004，36(4)：371-376.

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　　[9] SANCHEZ A P， ZHAO J H， YOU Y， et al. Role of the USF1 transcription factor in diabetic kidney disease[J]. American Journal of Physiology-Renal Physiology，2011，301(2)：271-279.