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單克隆抗體技術

摘要:[拼音]:dankelong kangti jishu [英文]:monoclonal antibody technology 20世紀後期免疫學技術的重大突破,應用B細胞雜交瘤技術產生單克隆抗體(McAb)。 B細胞雜交瘤是免疫的小鼠脾細胞 (B淋巴細胞)與小鼠骨髓瘤(...


[拼音]:dankelong kangti jishu

[英文]:monoclonal antibody technology

20世紀後期免疫學技術的重大突破,應用B細胞雜交瘤技術產生單克隆抗體(McAb)。 B細胞雜交瘤是免疫的小鼠脾細胞 (B淋巴細胞)與小鼠骨髓瘤(一種漿細胞瘤,漿細胞是B淋巴細胞系的終末形式)細胞融合而成的雜交細胞,其核內含有雙親細胞的染色體,繼承了親代細胞的特徵,它既具有瘤細胞在體外培養中迅速增殖的能力,又具備免疫脾細胞合成和分泌特異性抗體的特性。B細胞雜交瘤經過單個細胞培養,可繁殖成為一個細胞系(稱為克隆或克隆系),這個過程稱為克隆化,而由一個克隆系產生的抗體稱單克隆抗體。這種抗體只能特異地與抗原分子上的一個抗原決定簇結合反應,抗體成分均一,抗體的結構、氨基酸順序、特異性等都是一致的,且在培養過程中只要不發生變異,不同時間內分泌的抗體都能保持同樣的結構和功能。因此,用這種技術可按人們的意願生產大量很純的單克隆抗體,這些都是用普通血清學方法所不能達到的。這技術在醫學和生物學各個領域中得到廣泛應用,併為臨床疾病的診斷、治療提供了新手段。單克隆抗體與普通抗血清抗體的區別見圖。帶有多個抗原決定簇的抗原分子注入動物體內,被帶有相應抗原決定簇受體的淋巴細胞所識別,它們活化、增殖,每一個 B細胞系分別分泌針對單個抗原決定簇的抗體分子。普通抗血清是含有這些抗體的混合物。而將免疫小鼠的淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞,經過克隆化,所產生的抗體是高度純一的單克隆抗體。

單克隆抗體技術

B細胞雜交瘤單克隆抗體技術

先將免疫的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞在融合劑的作用下融合。融合後加入含有飼養細胞及次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)的選擇培基中篩選雜交瘤,測定抗體活性,進行克隆化,篩選出能產生所需特異性和性質的抗體的亞克隆,進行擴增培養或接種於同系小鼠的腹腔中,使其在動物體內增殖,從而能獲得大量的單克隆抗體。

骨髓瘤細胞系的選擇與培養

目前常用的適於融合的骨髓瘤細胞系多來自BALB/C小鼠和 Lou系大鼠。小鼠骨髓瘤細胞早期是採用缺少 HGPRT或TK酶但可分泌免疫球蛋白(無抗體活性)的骨髓瘤細胞 X63-Ag8細胞株。用X63-Ag8與免疫脾細胞融合形成的雜交瘤細胞,具有能合成兩個親代免疫球蛋白重鏈和輕鏈的基因,因而產生特異性抗體機率低。現多采用完全不產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞株 (稱為不產生者), 如SP2/O-Ag14、X63-Ag8.653 、FO等細胞系,這樣使雜交瘤細胞所分泌的免疫球蛋白只含有免疫脾細胞的重鏈和輕鏈,從而大大提高了所產生特異性抗體的比率。

骨髓瘤細胞系長期連續培養,可能會產生抗 HAT的變種,即由缺陷HGPRT回覆至能產生HGPRT的突變株,以致融合率下降。因此每隔3~6個月將骨髓瘤細胞置於含8-氮雜鳥嘌呤的培養液中培養,以除去回覆突變的細胞。必要時對骨髓瘤細胞系進行再克隆,選擇質量好的骨髓瘤亞克隆,並深凍一大批以供使用。用於融合的骨髓瘤細胞必須處於活躍的對數生長期。每隔2~3天應換新的培養液繼續傳代一次,可以使用於融合的骨髓瘤細胞保持在對數生長期一週左右,細胞存活率在90~95%。

免疫的小鼠脾細胞

由於供融合的小鼠骨髓瘤細胞系均來自BALB/C小鼠,故多選用同系BALB/C小鼠進行免疫。以8~12周齡雌性鼠為宜。大鼠可產生大量抗體,融合時亦可選用大鼠作為免疫脾細胞的供體。經特定抗原的免疫,小鼠脾臟中分泌特異性抗體的B細胞數量增加並分化、增殖為漿母細胞,這些細胞易與骨髓瘤細胞融合。

免疫程式與方法各實驗室不同,主要依抗原的性質及動物對抗原的免疫應答反應的不同來設計免疫方案。一般說,可溶化蛋白抗原的免疫原性弱,而應用佐劑加強免疫應答反應。初次免疫時將抗原與等量弗羅因德氏完全佐劑混合,腹腔或皮下注射。2~4周後以同量抗原加等量不完全弗羅因德氏佑劑腹腔注射。再過2~6周,在融合前3~4天,腹腔或靜脈注射不加佐劑的抗原作為加強免疫。完整的細胞免疫原性強,不需應用佐劑。由於動物對抗原的免疫反應可能有個體差異,最好一次免疫3~5只小鼠,選擇免疫反應好的小鼠,取混合脾進行融合,亦可分別取一個小鼠的脾臟分別進行3~5個融合。

融合的骨髓瘤細胞與免疫脾細胞的比例可以是1:1~1:10。但若脾細胞濃度過高,融合後多數培養孔中有多個雜交瘤細胞生長,使克隆化難以進行。一般在微量的多孔培養板中,每孔加入的融合後細胞總數以2×105個為宜,但最高細胞密度不得超過106個/孔。

融合劑

兩種細胞間的自發性融合率很低,一般為10-6~10-7。 細胞融合劑聚乙二醇(PEG)可促進細胞融合。作用機理可能為使脂膜易於開啟,通常用分子量1000~4000的50%PEG溶液, 在37℃和pH8~8.2,作用1~2分鐘效果最佳。有人認為PEG中加二甲亞碸作為融合劑,效果更好。

HAT選擇雜交瘤細胞

據報道用108個脾細胞與5×107個骨髓瘤細胞經PEG作用融合後,能存活下來,形成穩定雜交瘤的細胞數只不過100~200個,即以脾細胞計算為1/100萬或1/50萬,這樣培養物中未融合的骨髓瘤細胞的過度生長,將會干擾雜交瘤細胞的生存。為清除未融合的骨髓瘤細胞並且篩選出雜交瘤細胞,現普遍應用HAT選擇培養基, 其中含有次黃嘌呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶核苷。在 HAT培基中小鼠骨髓瘤細胞和脾細胞死亡,而雜交瘤細胞繁殖形成克隆。骨髓瘤細胞內缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 (HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(TK),不能利用培基中的次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷,所以未融合的骨髓瘤細胞不能繁殖。而小鼠脾細胞雖有HGPRT和TK,但缺乏在組織培基中繁殖的能力,一般在兩週內死亡。唯有骨髓瘤細胞和脾細胞融合形成的雜交瘤細胞,可以從小鼠脾細胞中獲得HGPRT和(或)TK,在HAT培養基中可通過核酸代謝旁路將次黃嘌呤合成嘌呤核苷酸和(或)將胸腺嘧啶核苷合成嘧啶核苷酸,進而合成DNA。因此雜交瘤細胞能在HAT培養基中繁殖成克隆。

飼養細胞

細胞溶合後,用 HAT培基選擇雜交瘤細胞時,由於骨髓瘤細胞和脾細胞大量死亡,單個或少數分散的雜交瘤細胞在低密度時不易存活,必需加入其他活細胞才能使之繁殖,這種被加入的活細胞叫做“飼養細胞”。常用的飼養細胞有小鼠腹腔巨噬細胞、小鼠脾細胞、小鼠或大鼠胸腺細胞、大鼠胚胎傳代纖維母細胞或經過γ射線照射的人胚肺纖維母細胞等。通常多采用腹腔巨噬細胞。飼養細胞可與融合細胞同時加到培養孔中,或提前一天加到培養孔中,由不同品系小鼠或異種鼠取得的腹腔巨噬細胞均同樣有效。小鼠腹腔巨噬細胞在效能上有差異,最好每次融合也用2~3個以上的小鼠腹腔混合液。

陽性雜交瘤細胞的篩選

細胞融合後,在HAT培養基中培養 5~14天,即可在培養板孔中生長出雜交瘤細胞集落,此時便可測定抗體活性,對能產生特異性抗體的雜交瘤細胞,應及早進行克隆化,以防因不產生抗體的雜交瘤細胞過度生長而丟失。另外,開始測定時由於分泌抗體陽性的雜交瘤細胞數尚少,可能測得抗體陰性,因此應重複測定抗體活性2~3次,並在換液後3~4天進行,以便抗體積累。為儘早篩選出分泌抗體的雜交瘤細胞,需要用敏感、可靠、快速的方法測定,常用的有固相放射免疫測定法(RIA),酶免疫分析法(EIA)和免疫熒光法(IFA)等來檢測上清中的微量抗體。

(1)固相放射免疫測定法:原理是抗原結合到固相載體的表面,並保持其免疫活性。若待測標本中存在對此抗原的特異性抗體,就會同吸附在載體表面的抗原結合,然後與放射性核素125Ⅰ標記的第二抗體一起孵溫育,即可根據放射性強度,判讀有無相應抗體的存在。本法敏感、簡便、準確,是目前篩選雜交瘤抗體最常用的方法。

(2)酶免疫分析法:常用的是間接法,原理是用酶標記的第二抗體篩選雜交瘤培養物上清中與抗原結合的抗體。此法的靈敏度和特異性與放射免疫測定法相似,但更簡便、快速,顯色反應可用肉眼鑑別,且酶標試劑比較穩定,是常用於初篩的方法。其缺點是某些細胞內有內源酶(如過氧化物酶),造成陰性對照本底較高,影響結果的判讀。此外,用該法不易查到對一小群細胞(細胞亞群)起反應的抗體,此時可能將這種弱反映誤認為本底而漏掉。

(3)免疫熒光法:採用熒光色素標記第二抗體,用間接免疫熒光染色法檢測活細胞膜表面抗原的抗體。本法已廣泛用於雜交瘤上清的篩選,能敏感地檢出抗細胞亞群表面抗原的抗體。免疫熒光法的全過程可在96孔聚乙烯微量板中進行,結合運用熒光啟用細胞分類儀(FACS)分離熒光染色陽性和熒光染色陰性的細胞。本法是大量、快速篩選分泌抗體的雜交瘤的有效方法,但因價格昂貴而不易推廣。

雜交瘤細胞的克隆化

對陽性孔的雜交瘤細胞進行克隆化,是獲得純的克隆系的一個重要步驟。克隆化時應注意:

(1)融合後,一旦抗體檢測陽性,應立即進行克隆化,同時雙份傳代,液氮凍存。

(2)融合後,待骨髓瘤細胞確已死亡,可將 HAT培養液換以HT培養液,初次克隆化時加HT。

(3)應用有限稀釋法進行克隆化時必須經過多次克隆(至少兩次以上),才能基本保證雜交瘤細胞為單克隆。

(4)克隆化後的雜交瘤細胞,在培養過程中有時也會發生變異或染色體丟失,失去產生特異性抗體的能力,因此需定期測定培養上清中抗體的滴度。若抗體滴度下降或轉陰性時,則應復甦原始凍存的細胞管,進行培養檢測,必要時應再克隆化和再凍存。

克隆化的方法為:

(1)有限稀釋法。本法簡便易行,不需特殊裝置,克隆效應高,故最常用。方法是將測得抗體陽性的雜交瘤細胞作連續稀釋,稀釋至每毫升含10個細胞或更少,按定量分種於含有飼養細胞層的96孔培養板中,直接觀察孔裡是否僅有一個細胞集落生長。在初次克隆化時,有的生長孔中只有一小部分有抗體活性,故應將陽性克隆細胞移至24孔培養板擴大培養,並凍存一部分細胞,及時進行再克隆,以提高抗體陽性克隆的百分率和保證雜交瘤細胞的單克隆化。

(2)軟瓊脂培養法。將適當濃度的雜交瘤細胞加至軟瓊脂培養基中,使由一個細胞增殖的克隆形成一個集落,將細胞集落擴大增殖培養,測定上清液的抗體活力,若為陽性就可選出所需抗體的克隆。本法的優點是細胞融合後可直接進行克隆化,其缺點是克隆陽性率低,克隆化所需細胞濃度較高,因此所得單個細胞集落並不能絕對代表單個細胞克隆,常需進行再克隆化。

雜交瘤細胞的增殖

一旦雜交瘤細胞成功地克隆化,就可進行大量增殖以產生抗體。其方法有:

(1)體外擴大培養法。剛獲得的雜交瘤細胞系不能耐受稀釋,因此培養物應逐漸擴大。先將96孔培養板中抗體陽性的細胞作1:3或1:5稀釋,移至24孔培養板中孵育,再將其中抗體陽性的細胞擴大到25cm2培養瓶,然後轉種至75cm2的大培養瓶中大量增殖,一般細胞培養上清的抗體含量可達5~50μg/ml。

(2)動物接種。將雜交瘤細胞接種於同系小鼠皮下或腹腔內,約10天后,分別自血清或腹水中獲取較大量的抗體。

雜交瘤細胞的儲存與復甦

在雜交瘤培養過程中應儘早地將抗體陽性的雜交瘤細胞凍存起來,放入液氮中(-196℃)儲存,以防因體外傳代培養的細胞突變或因汙染而丟失。

細胞復甦的方法是:從液氮中取出細胞管,立即放在37℃水浴中化凍,並立即用毛細吸管吸出細胞。放入培養液中離心,將沉澱的細胞懸於培養液中培養。

單克隆抗體的提純

一般常用金黃色葡萄球菌蛋白A-瓊脂糖4B親和層析法。

單克隆抗體的儲存

由腹水中獲得的抗體,經離心去除細胞成分,再經冷凍超速離心,取上清液加0.1%NaN3,少量分裝,冷凍於-70℃可儲存幾年。 但應避免反覆凍融,否則抗體失活,特別是IgM抗體。提純的單克隆抗體,冷凍乾燥保存於2~8℃,取出時溶解後,保存於2~8℃,至少一個月內可保持穩定。腹水抗體也可冷凍乾燥低溫(4℃)儲存兩年,融化後放置4℃下儲存一個月。短期使用的腹水抗體,4℃3~4 個月仍保持穩定, 培養上清加0.1%NaN3,貯於-20℃,兩年不失活性。

單克隆抗體在臨床上的應用

單克隆抗體用於臨床診斷和治療,目前研究較多的是抗人 T細胞單克隆抗體,用以識別人T細胞表面的不同抗原決定簇,有OKT系統及Leu系統。T細胞,特別是免疫調節T細胞(Ti/h及Tc/s細胞)對於調控免疫應答和維持免疫自穩起著至關重要的作用,臨床上許多疾病的發生與免疫調節失常有關,因此,研究 T細胞在這些疾病中的變化,有助於探討病因和輔助診斷。各種免疫缺損病、腫瘤或感染性疾病都與免疫功能低下有關,而變態反應性疾病、自身免疫性疾病等與免疫功能亢進有關。因此應用 OKT系列單克隆抗體檢測這些疾病患者外周血中T細胞亞群及T4/T8比值的變化,對探討發病機理,及時診斷疾病及監測病情發展有十分重要的意義。接受腎移植或骨髓移植的患者往往需應用各種免疫抑制劑以控制排斥反應, T細胞亞群的檢測有助於瞭解移植器官的排異和發展。

抗人 T細胞單克隆抗體可用以治療白血病、移植物抗宿主反應(GVHD)和急性腎排斥等,目前尚處於摸索階段。

參考書目

田渭濤:抗人T細胞單克隆抗體的應用及應注意的幾個問題,《上海免疫學雜誌》,6(3):186,1986 。

J.W.Golding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice ed.2.,Academic Press Inc.,Australia,1986.

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